胡鑫，劉劍侖，韋薇，鐘國(guó)斌 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧530007； 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

乳腺癌是危害女性健康的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有170萬(wàn)人發(fā)生乳腺癌，大約有50萬(wàn)人死于該病。雖然乳腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但是其發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家仍逐年升高[1]。因此，進(jìn)一步探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并尋找用于檢測(cè)和治療乳腺癌的新靶標(biāo)至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)，但具有生物學(xué)功能的RNA分子。lncRNA近年已被證實(shí)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[2～4]。lncRNA H19是lncRNA的一種，長(zhǎng)度為2.3 kb，位于染色體11p15.5[5]。研究報(bào)道，lncRNA H19在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)升高，能夠通過(guò)增強(qiáng)NF-κB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。2019年6月～2020年6月，本研究觀察了lncRNA H19對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，并探討其機(jī)制是否與靶向miR-194-5p表達(dá)有關(guān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人乳腺癌細(xì)胞系(SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7)和正常乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，基質(zhì)膠Matrigel與Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。主要儀器：酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。主要質(zhì)粒：pcDNA-H19、H19 siRNA、miR-194-5p minic均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞lncRNA H19表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7及MCF-10A細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。lncRNA H19上游引物5′ -GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3′，下游引物5′ -GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′ -AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明，PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 將SKBR3細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)75%左右時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKBR3細(xì)胞。將SKBR3細(xì)胞分為三組，pcDNA-H19組和si-H19組分別采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染pcDNA-H19、H19 siRNA，空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集三組細(xì)胞，參照1.2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)lncRNA H19表達(dá)。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。三組細(xì)胞以3×103/孔接種于96孔板，將含10% FBS的培養(yǎng)基加入孔板，使每孔液體量達(dá)到100 μL，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，三組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK-8試劑；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，然后使用酶標(biāo)儀系統(tǒng)檢測(cè)各孔450 nm處光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶4的比例稀釋Matrigel，以50 μL/孔包被Transwell小室，將小室放入24孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。常規(guī)消化三組細(xì)胞后用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，向小室內(nèi)分別加入三組細(xì)胞懸液200 μL，小室下層加入含10 % FBS的完全培養(yǎng)基500 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，用無(wú)菌棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下層細(xì)胞；1%吉姆薩染色，PBS沖洗3次，干燥后在倒置顯微鏡下對(duì)小室下層細(xì)胞拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)后取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取三組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化，以3×105/孔接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞基本長(zhǎng)滿時(shí)，使用20 μL小槍頭垂直背面的直線在6孔板中間劃線。PBS洗滌3次，洗去劃下的細(xì)胞，加入2 mL含10%FBS的培養(yǎng)基并拍照(此時(shí)記為0 h)。24 h后在相同位置拍照，使用Image J軟件計(jì)算三組細(xì)胞在0 h與24 h的距離，并計(jì)算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 lncRNA H19對(duì)miR-194-5p的調(diào)控作用觀察 ①采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。Starbase2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)軟件預(yù)測(cè)程序顯示，lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。用PCR法擴(kuò)增lncRNA H19上兩者的結(jié)合片段，并將該片段插入到pMIR-REPORT中，構(gòu)建lncRNA H19野生質(zhì)粒(H19-wt)，再應(yīng)用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，獲得lncRNA H19突變質(zhì)粒(H19-mut)。將SKBR3細(xì)胞接種至24孔板中，參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞分為四部分，分別進(jìn)行H19-wt、H19-mut與miR-194-5p mimic、NC mimic共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取1.3中的三組細(xì)胞，參照1.2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-194-5p表達(dá)，miR-194-5p上游引物5′-GCCGCTGTAACAGCAACTCCAT-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

圖1 Starbase2.0軟件預(yù)測(cè)程序顯示lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞lncRNA H19表達(dá)比較 乳腺癌細(xì)胞系SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7中l(wèi)ncRNA H19相對(duì)表達(dá)量分別為8.37±1.21、5.62±0.85、3.43±0.96，均高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中的1.08±0.24(P均<0.01)。其中，SKBR3細(xì)胞lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量升高最顯著，故選用SKBR3細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 三組lncRNA H19表達(dá)比較 si-H19組、空白對(duì)照組、pcDNA-H19組中l(wèi)ncRNA H19相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.08、1.08±0.10、3.04±0.32，三組lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量依次升高(P均<0.01)。

2.3 三組細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72、96 h，si-H19組、空白對(duì)照組、pcDNA-H19組相同時(shí)間點(diǎn)OD值均依次升高(P均<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 三組細(xì)胞增殖曲線

2.4 三組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 si-H19組、空白對(duì)照組、pcDNA-H19組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(31±2)、(65±3)、(102±5)個(gè)，劃痕愈合率分別為15.35%±0.88%、31.74%±2.27%、52.18%±2.89%，三組均依次升高(P均<0.01)。

2.5 SKBR3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19與miR-194-5p的相互作用結(jié)果 ①雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果:共轉(zhuǎn)染miR-194-5p mimic+H19-wt或NC mimic+H19-wt的SKBR3細(xì)胞熒光素酶活性分別為0.33±0.02、0.97±0.06(P<0.01)，共轉(zhuǎn)染miR-194-5p mimic+H19-mut或NC mimic+H19-mut的SKBR3細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.02±0.04、1.06±0.05(P>0.05)；提示lncRNA H19和miR-194-5p之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果:si-H19組、空白對(duì)照組、pcDNA-H19組miR-194-5p相對(duì)表達(dá)量分別為3.26±0.21、0.98±0.10、0.34±0.06，三組均依次降低(P均<0.01)。

3 討論

人類基因組中70%～90%的基因序列可轉(zhuǎn)錄為RNA，但是具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA只有2%，這些不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA稱為非編碼RNA(ncRNA)[7]。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，可通過(guò)多種表觀遺傳機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生重要的生物學(xué)作用，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。Qiu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1能夠通過(guò)靶向miRNA-526b/EZH2調(diào)控環(huán)加速非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。Li等[9]通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA FTX可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤生長(zhǎng)，這種作用可以被miR-144抑制。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lncRNA MATN1-AS1可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。

lncRNA H19是lncRNA中的一員，參與哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育，其表達(dá)量在組織器官成熟后逐漸下調(diào)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19表達(dá)在多種惡性腫瘤組織中重新上調(diào)，對(duì)于腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。Gao等[11]報(bào)道，lncRNA H19在肺腺癌組織中呈高表達(dá)，可通過(guò)介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤組織的體內(nèi)外生長(zhǎng)。在食管癌中，lncRNA H19在癌組織中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)STAT3/EZH2通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)高表達(dá)的lncRNA H19與食管癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)[12]。lncRNA H19還可通過(guò)抑制E-cadherin表達(dá)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其表達(dá)與膀胱癌患者的臨床分期顯著相關(guān)[13]。上述結(jié)果均表明，lncRNA H19能夠發(fā)揮原癌基因作用，但其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不明確。本研究結(jié)果顯示，lncRNA H19在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高，提示lncRNA H19可能參與乳腺癌的發(fā)生。為進(jìn)一步明確lncRNA H19對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本課題組在SKBR3細(xì)胞中干擾lncRNA H19表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力均減弱；而過(guò)表達(dá)lncRNA H19后，細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力均增強(qiáng)。這表明作為致癌lncRNA的lncRNA H19在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。

研究認(rèn)為，lncRNA-miRNA功能網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。目前，關(guān)于lncRNA H19的靶基因及其對(duì)乳腺癌致癌的分子機(jī)制尚不清楚。本課題組通過(guò)Starbase2.0預(yù)測(cè)程序發(fā)現(xiàn)lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。miR-194-5p被認(rèn)為是一類抑癌基因，可通過(guò)增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療藥物的敏感性而延緩卵巢癌進(jìn)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19過(guò)表達(dá)能明顯抑制SKBR3細(xì)胞miR-194-5p表達(dá)，沉默lncRNA H19后miR-194-5p表達(dá)升高，提示lncRNA H19可負(fù)靶向調(diào)控miR-194-5p表達(dá)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了lncRNA H19與miR-194-5p的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，乳腺癌細(xì)胞lncRNA H19表達(dá)升高，lncRNA H19可能通過(guò)負(fù)靶向調(diào)控miR-194-5p而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。