李長明，邵榮學，鄧小梅，趙士杰，王拓，全仁夫 杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，杭州300；杭州市中醫(yī)院

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，具有較高的致殘率，目前尚無效果很好的治療方法。隨著醫(yī)療技術水平的不斷提高，生物支架以其良好的生物相容性被越來越多地應用于外科手術中。SCI的主要病理機制是軸突失連、神經(jīng)細胞凋亡壞死等，導致機體不能進行有效的信號傳導。誘導性多能干細胞(IPSCs)能將某些轉(zhuǎn)錄因子通過基因轉(zhuǎn)染技術導入動物或人的體細胞內(nèi)，使體細胞直接重構(gòu)成為胚胎干細胞樣的多潛能細胞；重構(gòu)后的細胞具有與胚胎干細胞相似的自我更新能力和發(fā)育多潛能性，并可有效避免倫理問題，為SCI患者的康復帶來了希望。2017年5月～2018年5月，本研究通過對尿液細胞進行重編程建立IPSCs，并對其進行神經(jīng)干細胞(NSCs)方向的定向誘導分化，再將3D打印支架載IPSCs來源的NSCs移植至急性SCI大鼠的受損脊髓，觀察其對受損脊髓的修復作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：成年雄性SD大鼠56只，SPF級，體質(zhì)量(220±10)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。主要試劑：膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP，ab53554)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，aladdin P133293)、生長相關蛋白43(GAP-43，ab75810)、微管蛋白(β-tubulin Ⅲ，ab52623)均購于美國Abcam公司，硫酸肝素購于美國Sigma公司，巢蛋白抗體(Nestin，OM264981)購于美國OmnimAbs公司，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，bs-10445R)購于中國Bioss公司。主要儀器：熒光顯微鏡(CKX53)購于日本Olympus公司，3D打印機購于杭州捷諾飛生物科技有限公司，冷場發(fā)射高分辨掃描電鏡(S-4300)購于日本Hitachi公司。

1.2 尿液細胞來源IPSCs向NSCs的定向分化及鑒定

1.2.1 尿液細胞來源IPSCs的分離 經(jīng)杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院倫理委員會同意，采集1例23歲健康男性志愿者的尿液200 mL作為實驗標本。參照Zhou等[1]的方法分離尿液細胞并重編程為IPSCs，方法如下：收集尿液進行細胞培養(yǎng)，按1∶2～1∶3傳代。取第3代尿液細胞(呈現(xiàn)纖維樣或上皮樣，狀態(tài)良好)，使用Amaxa Basic Nucleofector試劑盒進行電轉(zhuǎn)染。待IPSCs克隆出現(xiàn)后，以堿性磷酸酶檢測試劑盒進行堿性磷酸酶活性檢測(AP染色)。AP染色結(jié)果顯示，尿液細胞來源的IPSCs克隆呈陽性。

1.2.2 IPSCs的鑒定 用玻璃針收集IPSCs克隆，并按1∶3～1∶5傳代。使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.25%(V/V)Triton X-100/PBS透膜10 min，室溫下4%(W/V)BSA封閉1 h。4 ℃條件下加入抗OCT4(1∶350，兔多克隆)、抗NANOG(1∶1 000，兔單克隆)、抗TRA-1-81(1∶100，小鼠單克隆)、抗TRA-1-60(1∶100，小鼠單克隆)一抗孵育過夜，室溫條件下加入山羊抗兔Alexa Fluor 488或568、山羊抗鼠Alexa Fluor 647二抗孵育30 min，以DAPI進行細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果顯示，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，IPSCs特異性免疫標記物OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60均呈陽性表達。

1.2.3 IPSCs向NSCs的誘導分化 將消化下來的IPSCs集落移至培養(yǎng)皿中，差速貼壁 30 min，去除分化細胞及飼養(yǎng)層細胞，收集懸浮細胞集落。用EB培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至細菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，隔天換液。懸浮培養(yǎng)4 d即形成成熟的擬胚體(EBs)，應用維甲酸(RA)+無血清培養(yǎng)基誘導，在EBs培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)4 d，換成無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)。將篩選培養(yǎng)得到的神經(jīng)球樣克隆命名為IPSCs-NSCs。

1.2.4 IPSCs-NSCs的鑒定 ①免疫熒光鑒定：取1.2.3誘導分化后的細胞，將已爬好細胞的培養(yǎng)皿用4%多聚甲醛固定15 min，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min，移液槍吸掉封閉液；培養(yǎng)皿內(nèi)滴加一抗Nestin(1∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加FITC(1∶100)熒光二抗，37 ℃孵育45 min；PBS沖洗，滴加DAPI避光孵育5 min進行細胞核染色。PBS沖洗多余的DAPI，50%甘油封閉培養(yǎng)皿。熒光顯微鏡下顯示IPSCs-NSCs特異性標志物Nestin表達陽性，呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，證實該細胞為IPSCs-NSCs。②分化能力檢測：取1.2.3誘導分化后的細胞，置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶先用0.1%明膠包被，觀察細胞形態(tài)變化，采用免疫熒光檢測β-tubulinⅢ和GFAP表達。結(jié)果顯示，GFAP目的蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，細胞向周圍延伸，提示細胞分化能力良好；β-tubulinⅢ目的蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，β-tubulinⅢ星形膠質(zhì)細胞大量表達，提示細胞分化能力良好。證實成功進行IPSCs向NSCs的定向分化，并制備IPSCs-NSCs。

1.3 海馬來源NSCs(Hd-NSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.3.1 Hd-NSCs的分離、培養(yǎng) 將新生(出生24 h內(nèi))的SD大鼠乙醇浸泡5 min，取出置于超凈平臺中；沿后中線開顱，Hanks液沖洗腦膜，取整個腦組織置于預先放有解剖液的無菌培養(yǎng)皿中；分離、取出海馬齒狀回，并剪碎、吹打；150目濾網(wǎng)過濾細胞勻漿，Hanks液清洗后加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃條件下消化30 min，棄胰酶、加入DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，銅網(wǎng)過濾并離心，制成單細胞懸液。0.4%臺盼藍染色觀察細胞存活率，細胞計數(shù)后接種，調(diào)整細胞密度為4×105～5×105/mL。培養(yǎng)液為添加B27(2%)、bFGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基。細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，隔日換液。

1.3.2 Hd-NSCs的鑒定 ①SABC免疫細胞化學染色：培養(yǎng)第6天，顯微鏡下可見神經(jīng)球，離心后制備單細胞懸液；吹打并取出少量滴加于經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，表面加少量DMEM無血清培養(yǎng)基，PBS液洗滌，冷風吹干。4%多聚甲醛固定，6 h后行常規(guī)SABC免疫細胞化學染色，一抗為Nestin (1∶400)。熒光顯微鏡下觀察Hd-NSCs特異性蛋白Nestin呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光。②Hd-NSCs向神經(jīng)元方向分化能力觀察：將培養(yǎng)3代的懸浮生長的細胞克隆離心(500 r/min)，吹打為單細胞懸液，種植在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，放于6孔培養(yǎng)皿中。每天觀察細胞生長狀態(tài)，常規(guī)換液。在分化1、3、5、7 d時，取出蓋玻片，常規(guī)進行NSE免疫細胞化學染色(一抗工作液濃度1∶200)，同時觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著分化時間的延長，NSE表達增加，提示細胞分化能力良好。③神經(jīng)元鑒定:參照1.2.3的培養(yǎng)條件，將神經(jīng)球種植于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，添加含有10%胎牛血清、NGF(1 ng/mL)、IGF-1(2 ng/mL)、胰島素(25 μg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基分化細胞。分別于分化1、3、5、7 d取出載玻片，進行漂洗、固定、常規(guī)SABC免疫細胞化學染色，DAB顯色，熒光顯微鏡觀察GAP-43的表達。結(jié)果顯示，隨著分化時間的延長，Hd-NSCs特異性蛋白GAP-43表達增加，提示神經(jīng)元發(fā)育與再生能力良好。

1.4 3D打印脊髓支架(簡稱3D支架)的制備 采用3D打印技術聯(lián)合真空冷凍干燥法。?、裥湍z原蛋白100 mg、Ⅱ型膠原蛋白10 mg以及硫酸肝素1 mg，加入 PLGA 200 mg，充分混勻。打開氮氣，將配制好的漿料置于物料桶內(nèi)，設置好分壓。選擇打印針頭并進行物料出料校準，設置與調(diào)節(jié)打印參數(shù)，包括出料溫度、平臺溫度等。三維支架成型，室溫下放置4 h以上，45、60 ℃分別恒溫干燥箱中持續(xù)干燥12 h。100倍電鏡下觀察顯示，制備的3D支架具有完美的內(nèi)部三維立體多孔結(jié)構(gòu)，支架橫截面掃描電鏡顯示內(nèi)部呈三維立體疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小為50 μm左右。

1.5 支架細胞預處理 將3D支架截成2～3 mm的小段，置于干細胞培養(yǎng)基中浸泡48 h，在無菌操作臺中風干，滅菌備用。將IPSCs-NSCs和Hd-NSCs培養(yǎng)至第7天時，消化計數(shù)；將1×106個細胞濃縮為0.2 mL，分別滴于預處理過的3D支架上，置于培養(yǎng)箱中2 h，用于后續(xù)實驗。

1.6 建模與分組處理 將56只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，每組14只。各組均按照以往的方法[2]用可控性皮質(zhì)脊髓撞擊儀構(gòu)建急性SCI模型，以開放領域運動測試(BBB)評分為0分定義為建模成功。常規(guī)護理1周，采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)進行腹腔注射麻醉，去除椎板，將損傷處的脊髓切除2～3 mm。IPSCs-NSCs組植入1.5中載IPSCs-NSCs的3D支架，Hd-NSCs組植入1.5中載Hd-NSCs的3D支架，模型組植入DMEM培養(yǎng)液0.2 mL，支架模型組植入載DMEM培養(yǎng)液0.2 mL的3D支架。

1.7 修復效果評價 ①BBB評分：術后2～8周，對各組大鼠后肢的運動情況進行BBB評分，BBB總分為21分，分數(shù)越高表示運動情況越好；②Tarlov、Rivlin評分：術后8周采用Tarlov和 Rivlin評分對各組大鼠后肢的運動功能進行評價，Tarlov、Rivlin評分越高表示運動功能越好；③運動、感覺誘發(fā)電位：術后8周采用誘發(fā)電位儀檢測各組大鼠的運動、感覺誘發(fā)電位；④病理觀察：術后8周處死各組大鼠，取受損節(jié)段脊髓組織，制備石蠟切片，HE染色觀察病理改變。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術后不同時間點BBB評分比較 見表1。

表1 各組大鼠術后BBB評分比較(分，

2.2 各組大鼠Tarlov、Rivlin評分比較 見表2。

表2 各組大鼠Tarlov、Rivlin評分比較(分，

2.3 各組運動、感覺誘發(fā)電位比較 IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組運動和感覺誘發(fā)電位潛伏期均短于模型組、支架模型組，運動和感覺誘發(fā)電位振幅均高于模型組、支架模型組(P均<0.05)。IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組運動和感覺誘發(fā)電位潛伏期、振幅比較差異均無統(tǒng)計學意義，支架模型組、模型組上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠運動、感覺誘發(fā)電位比較

2.4 各組病理改變比較 模型組脊神經(jīng)受到損傷，組織水腫，細胞稀疏，細胞間隙明顯增大；支架模型組細胞生長較模型組稍緊密，空泡減少；IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組脊神經(jīng)生長良好，組織生長間隙縮小，空泡減少，無組織水腫。

3 討論

急性SCI常見于暴力性外傷，具有較高的致殘率及病死率[3]。SCI的治療以外科手術為主，藥物及康復為輔，但這些常規(guī)治療方法缺乏特異性且療效不佳。近年來，組織工程學的興起給SCI的治療提供了新方向，生物支架+種子細胞+神經(jīng)因子的聯(lián)合移植修復被認為是治療神經(jīng)損傷的最佳療法[4, 5]。NSCs具有永久的增殖能力及多向分化功能，可分化成星形和少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元，具有營養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫和修復神經(jīng)損傷的作用，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的前景較好[6]。但是，來源于人類胎兒組織或者胚胎干細胞的NSCs通常存在倫理問題。IPSCs可將目的基因克隆到病毒載體中，然后導入機體成纖維細胞中，誘導其分化，并且不會發(fā)生免疫排斥[7]。IPSCs可以作為NSCs的來源，但IPSCs本身提取效率較低，導致該技術應用受限。目前，IPSCs可以從人成纖維細胞、人角質(zhì)細胞[8]、小鼠肝臟細胞[9]、人臍帶血細胞[10]以及脂肪來源細胞[11]中通過重編程獲得，但是大部分方法是有創(chuàng)取樣，導致樣本收集十分困難。

Zhou等[1]首次將人尿液細胞誘導為IPSCs，該方法具有無創(chuàng)且費用低的優(yōu)點。人體腎小管網(wǎng)絡龐大，每天有2 000～7 000個細胞從尿道、輸尿管上皮、膀胱、腎小管上皮脫落，并隨尿液排出體外[12]。這些細胞大部分保留有正常的功能且容易獲得，是進行體外研究的理想細胞來源。本研究成功收集了尿液細胞為細胞來源并誘導出IPSCs，且該IPSCs特異性免疫標記物OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60均呈陽性表達。宋旆文等[13]利用體外實驗制備骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，將其與NSCs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基可以促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，而向星形膠質(zhì)細胞的分化減少。本研究結(jié)果顯示，IPSCs-NSCs在培養(yǎng)基中穩(wěn)定增殖，體積不斷增大，培養(yǎng)液中神經(jīng)球數(shù)量亦不斷增多；GFAP目的蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，細胞向周圍延伸，提示細胞分化能力良好；β-tubulinⅢ目的蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色熒光，提示細胞分化能力良好。這證實成功將尿液細胞重編程為IPSCs，并誘導其分化為NSCs。

生物支架與種子細胞具有良好的相容性是組織工程學治療SCI的基礎，生物支架在治療中應確保種子細胞保留在脊髓損傷部位，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)微環(huán)境、填充病變腔并誘導其定向生長的作用[14]。3D支架是中空多孔的結(jié)構(gòu)，為上下行傳導束的重建和軸突生長提供通道，并除去物理隔離，對改善其物理微環(huán)境具有重要作用。本研究打印的3D支架孔徑約為50 μm，為細胞依附和增殖提供有利空間。曹宗銳等[15]研究顯示，采用膠原硫酸肝素制備的3D支架與NSCs具有較好的相容性。本研究Hd-NSCs和IPSCs-NSCs均能在3D支架孔中黏附、存活以及生長，表明該3D支架為Hd-NSCs和IPSCs-NSCs提供了較好的微環(huán)境，該3D支架與細胞之間具有較好的相容性。

脊髓損傷后局部膠質(zhì)瘢痕形成，上下行神經(jīng)傳導束中斷，微環(huán)境受損。因此，完整的脊髓是保證完整的纖維束、神經(jīng)元間互相正常聯(lián)絡的關鍵[16]。張仁坤等[17]采用生物支架聯(lián)合神經(jīng)細胞治療SCI，結(jié)果顯示患者的BBB評分、神經(jīng)電生理評分均明顯改善。Ren等[18]對SCI犬進行組織工程學治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其治療后的運動及纖維再生能力明顯改善。本研究結(jié)果顯示，IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組術后2～8周BBB評分、神經(jīng)電生理檢測結(jié)果以及術后8周的Tarlov、Rivlin評分均高于模型組和支架模型組，而IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組比較并無統(tǒng)計學差異。本研究病理觀察結(jié)果顯示，IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組脊神經(jīng)纖維生長良好，組織生長間隙縮小，空泡減少，無組織水腫；這表明尿液細胞來源IPSCs-NSCs移植能促進脊神經(jīng)纖維生長，為神經(jīng)細胞生長提供較好的微環(huán)境，其效果與Hd-NSCs相當。