仲麗麗,于穎，易婭靜，倪雪妍，劉思瑩，劉旭，劉宏 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱50040；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

阿爾茨海默病(AD)也稱老年癡呆，是一種起病隱匿的退行性神經(jīng)疾病，主要以大腦皮層顳葉和額葉萎縮為主[1, 2]。其臨床表現(xiàn)為緩慢進(jìn)展的認(rèn)知功能的全面衰退，如記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害、人格和行為改變等，病程長達(dá)數(shù)年或數(shù)十年。目前尚缺乏對AD有效的治療方法，因此研發(fā)AD的新型治療藥物十分必要。鞣花酸(EA)是一種廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的天然多酚類化合物[3]，具有酚類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。研究表明，EA在體內(nèi)外均有清除氧自由基、抗氧化作用[4, 5]，同時(shí)還具有抗菌、抗腫瘤、抑制細(xì)胞凋亡等作用[6～8]。研究顯示，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可較好地模擬AD的病理變化及行為學(xué)特征，可作為研究AD發(fā)病機(jī)制及開發(fā)AD防治藥物的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚9]。2019年9月～2020年7月，本研究觀察了EA對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并從氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、β淀粉樣蛋白表達(dá)等角度探究其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只，野生型C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量24～28 g，均購自南京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所。藥物與主要試劑：EA(批號：E102710)、二甲基亞砜(DMSO)均購自上海阿拉丁生化科技有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，β淀粉樣蛋白1-40、1-42(Aβ1-40、Aβ1-42)試劑盒及Caspase-3抗體購自中國武漢愛博泰克生物科技有限公司。主要儀器：光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司，Morris水迷宮購自安徽淮北正華生物儀器公司，酶標(biāo)儀購自美國RT公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將20只雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為APP/PS1組、APP/PS1+EA組，每組10只，10只野生型C57BL/6小鼠作為WT組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，APP/PS1+EA組按照50 mg/(kg·d)給予EA灌胃，WT組、APP/PS1組給予等體積DMSO灌胃，均連續(xù)給藥60 d。

1.3 學(xué)習(xí)、記憶能力觀察 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。各組給藥后先進(jìn)行連續(xù)4 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，每只小鼠每次訓(xùn)練120 s，每天訓(xùn)練2次；在訓(xùn)練過程中，若小鼠入水后找到并爬到站臺，則讓小鼠在平臺上停留30 s；若入水后2 min 內(nèi)小鼠未能找到或爬上站臺，則將其引導(dǎo)至站臺上并站立30 s；平臺停留后將小鼠取下休息，記錄各組小鼠2 min內(nèi)初次到達(dá)平臺的時(shí)間即潛伏期。實(shí)驗(yàn)第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，去掉水中平臺，記錄小鼠2 min內(nèi)的潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.4 腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達(dá)檢測 采用ELISA法。各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死，快速取腦組織；部分腦組織用4 ℃生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA、GSH-PX及Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 腦組織凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取各組小鼠部分腦組織，用4%多聚甲醛固定，依次乙醇梯度脫水，浸蠟、包埋組織，切片、沖洗、微波修復(fù)。使用3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，反復(fù)PBS沖洗5 min×3次，按照說明依次滴入一抗、二抗，沖洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水、樹脂膠封片。在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察Caspase-3蛋白陽性顆粒的表達(dá)情況并拍照，采用Imgagepro Plus6.0軟件分析圖像的積分光密度(IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組學(xué)習(xí)、記憶能力比較 與WT組比較，APP/PS1組、APP/PS1+EA組第1、2、4、5天潛伏期均延長(P均<0.05)；與APP/PS1組比較，APP/PS1+EA組第4、5天潛伏期均縮短(P均<0.05)；見表1。與WT組比較，APP/PS1組穿越平臺次數(shù)減少、目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短(P均<0.01)；與APP/PS1組比較，APP/PS1+EA組穿越平臺次數(shù)增加、目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(P均<0.05)；見表2。

表1 各組連續(xù)5 d潛伏期比較

表2 各組穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

2.2 各組腦組織SOD、MDA、GSH-PX、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與WT組比較，APP/PS1組腦組織SOD、GSH-PX蛋白表達(dá)均降低，MDA、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高(P均<0.05)；與APP/PS1組比較，APP/PS1+EA組腦組織SOD、GSH-PX蛋白表達(dá)均升高，MDA、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織SOD、MDA、GSH-PX、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)比較

3 討論

AD是臨床上常見的緩慢進(jìn)展且不可逆性的進(jìn)行性疾病，對患者家庭以及整個(gè)社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。對于AD的發(fā)病機(jī)制存在多種假說，包括氧化應(yīng)激、Aβ、Tau蛋白過度磷酸化、細(xì)胞凋亡、膽堿能系統(tǒng)失調(diào)等[10～13]。EA廣泛存在于多種水果和堅(jiān)果之中，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式中含有四個(gè)酚羥基，使其在生物活性方面具有較強(qiáng)的提供氫原子或與孤對電子配對的能力。因此，EA具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化能力[14, 15]。研究顯示，對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠給予灌胃富含EA的石榴汁后，小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力得到了明顯改善，小鼠腦組織中斑塊數(shù)量和Aβ堆積也顯著減少[16]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)常用于檢測小鼠的認(rèn)知功能。本研究結(jié)果顯示，與WT組比較，APP/PS1組第1、2、4、5天潛伏期均延長，第5天穿越平臺次數(shù)減少、目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，說明APP/PS1組發(fā)生認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低；與APP/PS1組比較，APP/PS1+EA組第4、5天潛伏期均縮短，第5天穿越平臺次數(shù)增加、目標(biāo)象限停留時(shí)間延長，說明EA可以減輕APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能障礙并提高其學(xué)習(xí)、記憶能力。

氧化應(yīng)激在AD發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可以導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡并加速AD的發(fā)生[17]。MDA是衡量機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要參考指標(biāo)，SOD和GSH-PX是抗氧化酶中的重要成員，可以幫助機(jī)體清除自由基，防止機(jī)體發(fā)生過氧化反應(yīng)。神經(jīng)元凋亡是AD發(fā)生的重要機(jī)制之一，其中Caspase-3是凋亡過程中處于中心環(huán)節(jié)的蛋白酶，也是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，可在細(xì)胞表面互相作用，參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Aβ沉積在AD發(fā)病過程中處于中心環(huán)節(jié)，也是AD發(fā)病的核心蛋白，是由39～42個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)[19]。淀粉樣前體蛋白APP水解生成Aβ，穿過血腦屏障后向外運(yùn)輸。正常情況下，機(jī)體內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中，若生成增多或清除減慢，則會(huì)出現(xiàn)Aβ在機(jī)體內(nèi)不斷積累、聚集、沉積，最后會(huì)形成老年斑。經(jīng)過一系列反應(yīng)，可引發(fā)AD的發(fā)生。Aβ1-40和Aβ1-42是Aβ的主要成分，Aβ1-42從時(shí)程和量的積累上均較Aβ1-40表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性，更加容易積累和聚集[20]。本研究結(jié)果顯示，與WT組比較，APP/PS1組腦組織SOD、GSH-PX蛋白表達(dá)均降低，MDA、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高，說明APP/PS1小鼠氧化應(yīng)激水平升高、神經(jīng)元凋亡明顯增加、Aβ蛋白表達(dá)升高；與APP/PS1組比較，APP/PS1+EA組腦組織SOD、GSH-PX蛋白表達(dá)均升高，MDA、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase-3蛋白表達(dá)均降低，說明EA具有顯著的抗氧化活性、海馬神經(jīng)元保護(hù)作用，并能有效降低Aβ蛋白表達(dá)。

綜上所述，EA可以改善AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，其作用機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激水平、減少神經(jīng)元凋亡及降低Aβ蛋白表達(dá)有關(guān)，為臨床治療AD提供一種新的方法和思路。