陳敏，黃照明，郭翔，畢虹，杜俊毅，楊超，楊麗娟，王麗艷，邱云花，金志賢 昆明市第一人民醫(yī)院附屬甘美醫(yī)院，昆明650224

慢性阻塞性肺疾病(COPD)-阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)重疊綜合征是由COPD和OSA重疊構(gòu)成的一種疾病。研究表明，COPD、OSA均存在血管內(nèi)皮損傷，而COPD-OSA重疊綜合征患者內(nèi)皮功能紊亂更重，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[1]。在前期研究中，本課題組成功采用煙熏聯(lián)合間歇低氧法構(gòu)建出COPD-OSA重疊綜合征大鼠模型，并證實(shí)COPD-OSA重疊綜合征大鼠體內(nèi)存在血管內(nèi)皮損傷[2]，但對(duì)于該重疊綜合征血管內(nèi)皮損傷修復(fù)治療的研究目前尚處于初始階段。Kim等[3]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)通過靜脈輸注后主要滯留在肺組織，并且肺氣腫模型組比正常組MSCs數(shù)量更多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化潛能，可能通過遷移、趨化到達(dá)病變部位發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，并具有抑制炎癥反應(yīng)、分泌細(xì)胞信號(hào)進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞的功能[4,5]。2016年10月～2018年12月，本研究對(duì)COPD-OSA重疊綜合征大鼠尾靜脈注入BMSCs，觀察其對(duì)大鼠肺血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：SPF級(jí)雌性SD大鼠18只，6～8周齡，體質(zhì)量150～180 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中進(jìn)行，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度60%±5%。主要試劑：99%氮?dú)赓徸岳ッ餮鯕鈴S，DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.25%胰酶均購自昆明貝爾吉生物科技有限公司，內(nèi)皮素1(ET-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)ELISA試劑盒均購自青島華美生物科技有限公司，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)購自武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司，BMSCs表面標(biāo)記CD90-FITC抗體、CD45-FITC抗體、CD29-FITC抗體、CD19-Fluor 488抗體均購自美國 eBioscience公司，CD34-cy3熒光抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 取SPF級(jí)雌性SD大鼠2只，采用頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨及脛骨；清除骨表面筋膜及肌肉，剪斷骨骺端，暴露骨髓腔。使用10 mL無菌注射器吸取無FBS的DEME-F12培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔；將骨髓液收集至離心管中，1 200 r/min離心5 min，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。棄上清，用含F(xiàn)BS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸稀釋;移至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液。去除未貼壁細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長速度，2～3 d換液1次。待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。取第3代純化的細(xì)胞，100倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示細(xì)胞呈長梭形、漩渦狀生長；采用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)記CD19-Fluor 488、CD29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC表達(dá)，結(jié)果顯示分離的細(xì)胞表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD19、CD45；參照BMSCs成骨誘導(dǎo)分化、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒說明書對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其具有成骨、成脂分化能力。所培養(yǎng)的細(xì)胞表型及功能鑒定均符合BMSCs特點(diǎn)，證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。

1.3 建模及分組處理 取SPF級(jí)雌性SD大鼠16只，參照前期試驗(yàn)采用煙熏聯(lián)合間歇低氧的方法制備COPD-OSA重疊綜合征大鼠模型，并進(jìn)行驗(yàn)證[2]。將16只COPD-OSA重疊綜合征大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組8只。取第3代BMSCs，經(jīng)消化、離心、生理鹽水重懸，制備密度為2×106/mL的細(xì)胞懸液。自建模開始后第4周開始，觀察組經(jīng)尾靜脈注射BMSCs 1 mL/次，1次/周，共4次；對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射等體積、等次數(shù)的生理鹽水。

1.4 肺組織標(biāo)本獲取 兩組治療后1周，給予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取右肺下葉于4%多聚甲醛固定24 h，避光保存待檢；取左肺組織，置入凍存管，-70 ℃冰箱保存待檢。

1.5 肺組織及肺小動(dòng)脈病理觀察 取兩組4%多聚甲醛固定的右肺下葉，乙醇脫水后常規(guī)石蠟包埋、3 μm厚切片。行HE染色，觀察肺組織病理改變；行MASSON染色，觀察肺小動(dòng)脈病理改變。

1.6 肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況觀察 采用DAPI-CD34-TUNEL三重定性法。取兩組4%多聚甲醛固定的右肺下葉，乙醇脫水后常規(guī)石蠟包埋、3 μm厚切片。進(jìn)行DAPI細(xì)胞核染色(藍(lán)光)，CD34免疫熒光(紅光)和TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞(綠光)。觀察標(biāo)本的特異性紅色熒光強(qiáng)度，同時(shí)顯示藍(lán)光和紅光的細(xì)胞為CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)顯示藍(lán)光、紅光、綠光的細(xì)胞為凋亡的CD34陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞。針對(duì)每例標(biāo)本的藍(lán)光-紅光-綠光合成圖，每組內(nèi)每張切片挑選至少3個(gè)400倍視野進(jìn)行截圖，截圖時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。采用Image-Pro Plus6.0軟件選取發(fā)出紅色-綠色熒光的細(xì)胞核定義為陽性細(xì)胞，選取發(fā)出藍(lán)色的細(xì)胞核定義為總細(xì)胞，分析每張照片的陽性細(xì)胞數(shù)以及總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值。

1.7 肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達(dá)檢測 采用ELISA法。取兩組冰箱保存的左肺組織，勻漿后離心；設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣本孔，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μL，37 ℃孵育2 h；分別加入生物素標(biāo)記抗體工作液、加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，避光顯色；使用酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度(OD)值。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺組織、肺小動(dòng)脈病理改變情況 ①肺組織病理改變：對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的肺氣腫特征，肺泡腔擴(kuò)大，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)見炎性滲出；支氣管壁大量淋巴細(xì)胞增生，細(xì)支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細(xì)胞增生；肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)增厚，氣管壁淋巴細(xì)胞浸潤，部分血管壁淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤。觀察組肺氣腫程度較輕，肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤以及支氣管壁淋巴細(xì)胞增生、細(xì)支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細(xì)胞增生等改變均較對(duì)照組減輕。見圖1。②肺小動(dòng)脈病理改變：對(duì)照組肺小動(dòng)脈肌化明顯增強(qiáng)，外膜膠原纖維高度沉積，血管壁正常結(jié)構(gòu)喪失，血管周圍炎癥明顯，肺間質(zhì)增厚明顯；觀察組肺小動(dòng)脈肌化、外膜膠原纖維沉積、血管壁結(jié)構(gòu)異常、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)增厚等均較對(duì)照組減輕。見圖2。

注：A為觀察組;B為對(duì)照組。

2.2 兩組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較 觀察組與對(duì)照組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率分別為2.355 2%±0.392 3%、1.333 9%±0.155 3%，兩組比較P<0.01。

2.3 兩組肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達(dá)比較 觀察組肺組織ET-1、VEGF表達(dá)均低于對(duì)照組，eNOS表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。兩組肺組織SDF-1α表達(dá)比較P>0.05。見表1。

注：A為觀察組;B為對(duì)照組。

表1 兩組肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達(dá)比較

3 討論

血管內(nèi)皮的完整性對(duì)于人體血液循環(huán)和全身組織的生理屏障作用至關(guān)重要，但缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)活性改變等因素均參與了COPD、OSA的發(fā)生、發(fā)展，這些因素均可引起血管內(nèi)皮損傷及功能障礙[6,7]，從而導(dǎo)致血管收縮、血液高凝甚至形成血栓，從而引發(fā)心腦血管事件的發(fā)生。在前期研究中我們已證實(shí)COPD-OSA重疊綜合征大鼠體內(nèi)存在血管內(nèi)皮損傷，但目前對(duì)于這種損傷的修復(fù)治療尚處于初始階段。

BMSCs是未分化的細(xì)胞，能從骨髓動(dòng)員到其他器官，歸巢到受損傷組織，可以分化血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，從而發(fā)揮修復(fù)功能。BMSCs具有取材方便、培養(yǎng)簡單、增殖快、免疫原性低等特點(diǎn)，并具有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)炎癥及氧化應(yīng)激。既往研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs條件培養(yǎng)基可以抑制低氧誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而修復(fù)血管內(nèi)皮損傷[8]。有研究將BMSCs條件培養(yǎng)基注射到大鼠皮膚傷口，發(fā)現(xiàn)BMSCs可修復(fù)血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)新生血管形成，從而促進(jìn)皮膚傷口愈合[9]。研究顯示，BMSCs可修復(fù)野百合堿所致肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的血管內(nèi)皮損傷、減輕肺血管重塑、改善血管舒張功能、有效降低肺動(dòng)脈壓力及改善心功能[10]。結(jié)合既往關(guān)于COPD、OSA及肺動(dòng)脈高壓等動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測BMSCs修復(fù)血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制可能有：①下調(diào)多種炎癥介質(zhì)(如IL-6、IL-1β、C反應(yīng)蛋白等)來抑制炎癥反應(yīng)[11,12]；②抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[13,14]；③分泌某些抗細(xì)胞凋亡因子(如IL-6、人單核細(xì)胞趨化蛋白1)及促進(jìn)血管生長因子(如VEGF)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，還可能分泌某些細(xì)胞因子激活PI3K/AKT通路而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]；④分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞,以減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10,15]。

NO和ET-1是相拮抗的內(nèi)皮源性舒張因子，可有效反映血管內(nèi)皮損傷的狀態(tài)。NO由eNOS催化底物L(fēng)-精氨酸合成，低氧可造成內(nèi)皮細(xì)胞eNOS合成減少、活性降低。VEGF是特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子，其合成和分泌受缺氧、癌基因、細(xì)胞因子、細(xì)胞間質(zhì)成分等多種因素影響[16]。SDF-1α是細(xì)胞膜半胱氨酸-X-半胱氨酸趨化因子之一，可動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞到外周血，并遷移到血管受損處，具有修復(fù)損傷血管內(nèi)皮及促進(jìn)新生血管形成的作用[17,18]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的肺氣腫特征，具有肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤以及支氣管壁淋巴細(xì)胞增生、細(xì)支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細(xì)胞增生等明顯改變，肺小動(dòng)脈病理變化顯示肌化、外膜膠原纖維沉積、血管壁結(jié)構(gòu)異常、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)增厚等明顯改變，而觀察組上述變化均較對(duì)照組減輕，說明BMSCs對(duì)COPD-OSA重疊綜合征大鼠的肺血管內(nèi)皮損傷具有明顯的修復(fù)作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及ET-1表達(dá)均低于對(duì)照組，eNOS表達(dá)高于對(duì)照組；說明BMSCs可能通過降低血管內(nèi)皮損傷因子ET-1表達(dá)及升高血管內(nèi)皮保護(hù)因子eNOS表達(dá)，而發(fā)揮減輕血管內(nèi)皮損傷的作用。

研究表明，缺氧可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞合成缺氧誘導(dǎo)因子，激活缺氧感受基因，繼而引起 VEGF表達(dá)上調(diào)[19]。間歇低氧可刺激HIF-1α、VEGF、SDF-1α為主的大量交感刺激因子逐漸釋放以適應(yīng)低氧[20]。COPD-OSA重疊綜合征患者血清VEGF水平高于中重度COPD及中重度OSA患者[21]。另有研究表明，BMSCs本身具有分泌VEGF的作用，尾靜脈移植BMSCs可在COPD大鼠模型肺組織定植、分化為肺泡壁細(xì)胞，肺泡壁細(xì)胞亦可分泌VEGF等物質(zhì)[22]。本研究結(jié)果顯示,觀察組肺組織VEGF表達(dá)低于對(duì)照組；結(jié)合目前相關(guān)研究，分析原因可能為BMSCs尾靜脈移植治療通過改善大鼠缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等機(jī)制，導(dǎo)致其對(duì)VEGF的降低作用超過了BMSCs通過自身分泌及轉(zhuǎn)化為肺泡壁細(xì)胞后分泌對(duì)VEGF的升高作用，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。