陳立功,吳家葳,張慶芳,遲乃玉,王曉輝,*

(1.大連大學生命科學與技術(shù)學院,遼寧大連 116622;2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116622)

幾丁質(zhì)(chitin)是自然界含量十分豐富的生物多糖,是N-乙酰氨基葡萄糖單體的天然多聚體[1-2]。幾丁質(zhì)在自然界中廣泛存在,真菌、昆蟲外骨骼及節(jié)肢動物外殼中都含有幾丁質(zhì)成分。它是海洋中蝦蟹殼的主要成分,主要是作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)起支撐和保護的作用[3-4]。幾丁質(zhì)主要來源于海洋,但每年有超過8萬噸幾丁質(zhì)被視為廢物丟棄[5-6]。近些年來隨著人們對海洋的不斷探索,對海洋資源的不斷開發(fā)利用,以及在環(huán)境保護、能源利用等領域的研究進展,人類越來越認識到幾丁質(zhì)作為地球上含量豐富的天然多糖,具有被變廢為寶的潛力。研究顯示,幾丁質(zhì)降解后產(chǎn)生的不同聚合度的幾丁寡糖或幾丁單糖,具有良好的誘導植物抗病性及抗菌等作用,被廣泛地應用于農(nóng)業(yè)、保健及化妝品等行業(yè)[7-10]。

幾丁質(zhì)酶(chitinase,EC 3.2.1.14)通過水解β-(1→4)糖苷鍵降解幾丁質(zhì),廣泛存在于各種真菌、細菌、動植物中[10-11]。因幾丁質(zhì)酶能夠通過降解真菌細胞壁及昆蟲外骨骼中的幾丁質(zhì)成分,對其產(chǎn)生殺傷作用,故在農(nóng)業(yè)中可用來抑菌和殺蟲[12-15]。幾丁質(zhì)的生物降解主要是通過幾丁質(zhì)酶來實現(xiàn)的,相比于物理降解法和化學降解法,生物降解法具有高效綠色等優(yōu)勢[16-17]。

近些年來,微生物幾丁質(zhì)酶系的研究已經(jīng)較為系統(tǒng),但海洋來源的幾丁質(zhì)酶的相關研究較少[18]。報道發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶大多為中高溫酶,需要在40～50 ℃溫度下充分發(fā)揮作用,限制了其應用范圍,增加了生產(chǎn)成本[19-20]。海洋微生物產(chǎn)生的低溫酶由于其特殊的晶體結(jié)構(gòu)使其比中溫酶、高溫酶更有優(yōu)勢。該酶具有低溫下高酶活力及高催化效率、結(jié)構(gòu)高效柔順性和熱不穩(wěn)定性(經(jīng)過溫和的熱處理,在不影響產(chǎn)品品質(zhì)的情況下即可使低溫酶的活力喪失)等生物學特性[21-23]。目前,國內(nèi)外研究中未見發(fā)光桿菌屬菌株產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件優(yōu)化的相關報道。

本研究選取具有低溫、低光照等特點的海洋環(huán)境[24-25]為菌株來源庫,以渤海海域海泥為樣品,經(jīng)平板篩選得到產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的菌株,對其進行了形態(tài)學鑒定、分子生物學鑒定及最佳產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來源 中國遼寧大連渤海海域海底泥(123°391′E,39°6972′N)；篩選培養(yǎng)基 膠體幾丁質(zhì)1.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,K2HPO45.0 g/L,KH2PO45.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,MgSO4·7H2O 5.0 g/L,ZnSO4·7H2O 5.0 g/L,FeSO4·7H2O 5.0 g/L,瓊脂1.5%～2.0%,海水,pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基、2216E種子培養(yǎng)基 參考王曉輝等[26]的配方；幾丁質(zhì) 生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司；CRY-2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司；Thermo Multiskan1510酶標儀 芬蘭Labsystems公司；CI-L型顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì) 根據(jù)王曉輝等[26]的方法進行1%膠體幾丁質(zhì)的制備。

1.2.2 篩選方法 菌株初篩:取海泥樣品加入無菌水中,輕微振蕩使其完全溶解。梯度稀釋后按梯度(10-4、10-5、10-6)涂布于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng),挑取產(chǎn)生透明圈的菌株進行劃線純化。菌株復篩:1%接種量將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng),20 ℃、160 r/min培養(yǎng)2～3 d后進行酶活驗證,取發(fā)酵液10000 r/min離心10 min,取上清液檢測酶活。

1.2.3 酶活測定 取上清0.5 mL,與0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)混合,35 ℃下水浴保溫15 min,10000 r/min離心5 min,取上清200 μL煮沸5 min,冷卻后,加入200 μL DNS溶液煮沸5 min,冷卻后加入600 μL超純水,10000 r/min離心10 min,取200 μL于96孔板中測定OD520,三組平行實驗[27]。酶活單位定義(U):在上述條件下,催化產(chǎn)生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.4 菌株鑒定 形態(tài)學鑒定:參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行形態(tài)學鑒定；分子生物學鑒定:將菌株送往上海京通生物科技有限公司進行16S rDNA鑒定。

1.2.5 生長曲線與產(chǎn)酶曲線 5 mL種子培養(yǎng)基中接種純化菌株的單菌落,并于20 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。

生長曲線測定:1%接種量將種子液接種至100 mL 2216E培養(yǎng)基,20 ℃、160 r/min發(fā)酵,4 h檢測一次OD600。三組平行實驗。

產(chǎn)酶曲線測定:1%接種量將種子液接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,20 ℃、160 r/min發(fā)酵,4 h檢測一次酶活。三組平行實驗。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化試驗 碳源種類優(yōu)化:碳源種類為膠體幾丁質(zhì)、粉狀幾丁質(zhì)、k-卡拉膠、褐藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、發(fā)酵用麩皮、發(fā)酵用秸稈粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉,碳源添加量為5.0 g/L,胰蛋白胨5.0 g/L,發(fā)酵溫度20 ℃,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

碳源添加量優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)添加量為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 g/L,胰蛋白胨5.0 g/L,發(fā)酵溫度20 ℃,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

氮源種類優(yōu)化:氮源種類為胰蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米漿、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨、尿素,氮源添加量為5.0 g/L,膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,發(fā)酵溫度20 ℃,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

氮源添加量優(yōu)化:酵母膏添加量為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L,膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,發(fā)酵溫度20 ℃,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

發(fā)酵溫度優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為5 ～50 ℃,梯度間隔為5 ℃,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

發(fā)酵初始pH優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為15 ℃,初始pH為3.0～12.0,裝液量100 mL/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

裝液量優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為15 ℃,初始pH7.0,裝液量為(25、50 、75、100、125、150、175 mL)/250 mL,接種量1%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

接種量優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為15 ℃,初始pH7.0,裝液量為75 mL/250 mL,接種量為0.4%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%,于160 r/min搖床中培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為15 ℃,初始pH7.0,裝液量為75 mL/250 mL,接種量1%,發(fā)酵轉(zhuǎn)速為80～240 r/min,梯度間隔為20 r/min,培養(yǎng)80 h,檢測酶活。

發(fā)酵時間優(yōu)化:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L,酵母膏6.0 g/L,發(fā)酵溫度為15 ℃,初始pH7.0,裝液量為75 mL/250 mL,接種量1%,發(fā)酵轉(zhuǎn)速220 r/min,每隔12 h檢測酶活。

所有實驗均為三組平行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8.0.1軟件對發(fā)酵條件優(yōu)化數(shù)據(jù)進行處理,所有實驗均為三組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定結(jié)果

篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后,平板上長出帶有透明圈的菌株,挑取該菌株進行三區(qū)劃線純化。純化后得到單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵后進行酶活檢測復篩,確定該菌株為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株,命名為LG-1。

形態(tài)學鑒定結(jié)果:將菌株LG-1劃線在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上,20 ℃生長2 d后觀察菌落形態(tài),單個菌落呈白色或淡黃色,不透明,表面光滑且邊緣整齊,中間略厚,易挑取；挑取單菌落染色后進行顯微形態(tài)觀察,該菌株為兩端圓的短桿狀,無芽孢；簡單染色及革蘭氏染色結(jié)果表明,該菌為革蘭氏陰性桿菌,參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》可以初步判斷為發(fā)光桿菌屬,具體判斷需要進一步進行16S rDNA序列測定,如圖1。

圖1 菌株LG-1的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)

分子生物學鑒定結(jié)果:將16S rDNA測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫基因序列進行比較,搜索得到同源性達到99%以上的菌株,均為發(fā)光桿菌。結(jié)合形態(tài)學特征綜合比較,確定菌株LG-1為發(fā)光桿菌屬,圖2為Photobacteriumsp. LG-1的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2 Photobacterium sp. LG-1的16S rDNA的序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 生長曲線與產(chǎn)酶曲線測定

如圖3所示,菌株LG-1在該條件下培養(yǎng)時,接種后發(fā)酵培養(yǎng)8 h內(nèi)為延滯期,此階段菌株生長緩慢,酶活性較低；此后菌株進入對數(shù)生長期,此階段增殖加快,發(fā)酵液內(nèi)菌體濃度迅速增加,這一階段幾丁質(zhì)酶活性亦快速升高；大約52 h時菌株生長進入穩(wěn)定期,此階段菌株代謝活動減慢,增殖速度隨之降低,發(fā)酵液內(nèi)菌體濃度相對穩(wěn)定；菌株生長進入72 h后,緩慢進入衰亡期,此階段菌株增殖速度小于死亡速度,可能因為發(fā)酵進入此時期時,發(fā)酵液內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多,不能滿足大量菌體生長繁殖需要。菌株LG-1在發(fā)酵培養(yǎng)及中培養(yǎng)80 h時幾丁質(zhì)酶活達到最大值,為0.932 U/mL。確定該菌株產(chǎn)酶最適培養(yǎng)時間為80 h。

圖3 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌LG-1生長曲線及產(chǎn)酶曲線

2.3 菌株LG-1產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 碳源種類優(yōu)化結(jié)果 由圖4可以看出,幾丁質(zhì)是該菌株生長產(chǎn)酶的優(yōu)良碳源,且膠體幾丁質(zhì)比晶體粉狀幾丁質(zhì)對菌株產(chǎn)酶有更好的誘導能力,確定膠體幾丁質(zhì)是誘導菌株LG-1產(chǎn)酶的最優(yōu)碳源。k-卡拉膠、褐藻酸鈉、淀粉、發(fā)酵用麩皮、發(fā)酵用秸稈粉有一定的誘導產(chǎn)酶能力。

圖4 碳源種類對酶活的影響

2.3.2 碳源添加量優(yōu)化結(jié)果 在一定濃度范圍內(nèi),膠體幾丁質(zhì)濃度與幾丁質(zhì)酶活性呈正比例關系(如圖5),且當膠體幾丁質(zhì)濃度處于較低濃度時,其濃度的改變會對幾丁質(zhì)酶活性產(chǎn)生明顯影響；當發(fā)酵液中膠體幾丁質(zhì)濃度為12 g/L時,幾丁質(zhì)酶的酶活達到最高,超過12 g/L后幾丁質(zhì)酶活下降。因此,確定最佳膠體幾丁質(zhì)濃度為12 g/L。

圖5 膠體幾丁質(zhì)濃度對酶活的影響

2.3.3 氮源種類優(yōu)化結(jié)果 結(jié)果如圖6所示,酵母膏是菌株LG-1產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最優(yōu)氮源,且胰蛋白胨、牛肉膏對菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶亦有較好的誘導作用；相比而言,硝酸鉀、酵母粉及硫酸銨誘導菌株產(chǎn)酶的能力相對較弱；而有機氮源中的玉米漿、無機氮源中的硝酸銨和尿素則不能誘導菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

圖6 氮源種類對酶活的影響

2.3.4 氮源添加量優(yōu)化結(jié)果 由圖7可知,低濃度和高濃度的酵母膏都不利于菌株LG-1產(chǎn)幾丁質(zhì)酶,隨著酵母膏濃度增加,幾丁質(zhì)酶活性先升高后下降,幾丁質(zhì)酶的活性在酵母膏濃度為6 g/L時達到最大。因此,確定最佳酵母膏濃度為6 g/L。

圖7 酵母膏濃度對酶活的影響

2.3.5 發(fā)酵溫度優(yōu)化結(jié)果 由圖8可知,當發(fā)酵溫度為15 ℃時,菌株LG-1發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活性最高,且當發(fā)酵溫度為5 ℃時,此時溫度較低,大多數(shù)菌株在此溫度下生長代謝緩慢或處于休眠狀態(tài)[4],而菌株LG-1卻仍能生長產(chǎn)酶；當發(fā)酵溫度增加至30 ℃后,幾丁質(zhì)酶活性很低,相比較而言,該菌株在相對較低溫度下更利于產(chǎn)酶。因此,最佳發(fā)酵溫度為15 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對酶活的影響

2.3.6 初始pH優(yōu)化結(jié)果 如圖9所示,菌株LG-1在pH7.0時產(chǎn)酶活力最高,表明菌株在偏中性的環(huán)境中更易生長產(chǎn)酶,在pH6～8范圍內(nèi)菌株產(chǎn)酶能力較高,環(huán)境過酸過堿都會影響幾丁質(zhì)酶的活性。因此,確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0。

圖9 初始pH對酶活的影響

2.3.7 裝液量優(yōu)化結(jié)果 由圖10可知,當裝液量為75 mL/250 mL時菌株LG-1產(chǎn)酶最高,增大或減少裝液量都會使酶活性降低,較高的裝液量直接影響培養(yǎng)基中的溶氧,說明菌株LG-1為需氧發(fā)酵。因此,確定最適裝液量為75 mL/250 mL。

圖10 裝液量對酶活的影響

2.3.8 接種量優(yōu)化結(jié)果 如圖11所示,接種量為1%時,幾丁質(zhì)酶活性最高,幾丁質(zhì)酶活性隨著接種量的增大而降低,這可能是因為過高的接種量會使培養(yǎng)基中物質(zhì)急劇消耗,較高的菌濃度會大量消耗培養(yǎng)基中的氧氣。故1%為菌株LG-1的最佳接種量。

圖11 接種量對酶活的影響

2.3.9 發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果 結(jié)果如圖12所示,較低轉(zhuǎn)速菌株LG-1產(chǎn)酶能力較低,隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增加,幾丁質(zhì)酶活性增加,當轉(zhuǎn)速為220 r/min時,酶活達到最高點,增大轉(zhuǎn)速可以增加培養(yǎng)基中的溶氧量,結(jié)合裝液量和接種量優(yōu)化結(jié)果,說明菌株LG-1發(fā)酵對溶氧量要求較高。因此,確定最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖12 轉(zhuǎn)速對酶活的影響

2.3.10 發(fā)酵時間優(yōu)化結(jié)果 由圖13可知,相比于優(yōu)化前,菌株快速產(chǎn)酶時間有所推遲,從48 h開始酶活性急劇增加,在96 h時酶活達到最高,為4.566 U/mL。

圖13 發(fā)酵時間對酶活的影響

3 結(jié)論與討論

從“適者生存”的觀點出發(fā),能夠在海洋這種低溫、低光照環(huán)境中生存的微生物,其自身及其產(chǎn)生的酶極有可能具備耐低溫和低溫下仍然具有較高活力的特點。所以,本研究以海洋底泥為樣品,篩得1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高的菌株,經(jīng)形態(tài)學鑒定及分子生物學鑒定為革蘭氏陰性發(fā)光桿菌,命名為Photobacteriumsp. LG-1,酶活復篩證明該菌株對幾丁質(zhì)有較好的降解作用。

本實驗篩選到的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌LG-1對膠體幾丁質(zhì)及晶體粉狀幾丁質(zhì)有很好的降解作用,且兩者誘導產(chǎn)酶相差不大,自然狀態(tài)下,幾丁質(zhì)以晶體形式存在,膠體幾丁質(zhì)需要通過在粉狀幾丁質(zhì)中加入強酸并通過一定過程才能制成,增加了生產(chǎn)成本且造成了環(huán)境污染及資源浪費[28-30]。LG-1對晶體幾丁質(zhì)的降解能力使得其完全可以直接以蝦蟹殼為原料,進行低溫幾丁質(zhì)酶的誘導分泌,大大降低了成本。同時LG-1還有較好的淀粉酶活性,對k-卡拉膠、褐藻酸鈉、發(fā)酵用麩皮、發(fā)酵用秸稈粉有一定降解能力,具有廣闊的工業(yè)應用前景。

為了獲得更多高活性、高質(zhì)量的低溫幾丁質(zhì)酶,對菌株LG-1最佳產(chǎn)酶條件進行了單因素優(yōu)化,實驗結(jié)果表明,菌株LG-1在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶能力有很大差異,膠體幾丁質(zhì)和酵母膏能夠大量誘導菌株產(chǎn)酶；菌株在較低溫度下產(chǎn)酶能力明顯強于高溫,這可能與菌株來源和低溫幾丁質(zhì)酶特性有關；裝液量、接種量及發(fā)酵轉(zhuǎn)速結(jié)果表明,較低的裝液量和較高的轉(zhuǎn)速更利于菌株產(chǎn)酶,說明菌株發(fā)酵產(chǎn)酶對溶氧量需求較高。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果為:膠體幾丁質(zhì)12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、初始pH7.0、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、海水1 L,在15 ℃,220 r/min培養(yǎng)96 h,酶活力達4.566 U/mL,相比于未優(yōu)化前的酶活0.932 U/mL,提高了389.91%。且該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在低溫下仍有很高活性,若應用于工業(yè)生產(chǎn)會大大降低生產(chǎn)成本,具備較大的應用潛力。

本研究從產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株篩選開始,對所獲得菌株Photobacteriumsp. LG-1進行了發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化,大大提高了菌株Photobacteriumsp. LG-1的產(chǎn)酶活性。下一步研究方向會在單因素優(yōu)化的基礎上,對菌株產(chǎn)酶活性進行響應面的優(yōu)化,完成系統(tǒng)性的產(chǎn)酶優(yōu)化過程,進一步提高其產(chǎn)酶活性,并對其發(fā)酵條件進行5 L放大,滿足基本實驗需求的同時,逐漸向工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)酶邁進。本實驗為下一步幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)研究及產(chǎn)業(yè)應用提供參考。