馮旸旸,王 浩,于 棟,徐敬欣,孔保華,劉 騫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

乳清蛋白是干酪生產(chǎn)副產(chǎn)物中乳清的主要成分,其主要包含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白等組分。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同可以分為乳清分離蛋白(Whey protein isolate,WPI)和乳清濃縮蛋白(Whey protein concentrate,WPC)[1]。乳清蛋白憑借其營養(yǎng)豐富、消化吸收率高的特點(diǎn),享有“蛋白之王”的美稱,而且經(jīng)常被作為功能性食品配料或添加成分用于食品工業(yè)中[2]。然而,由于β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)缺陷,使得乳清蛋白具有一定的致敏性,極大地限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。因此,許多研究者嘗試采用不同的改性技術(shù)處理乳清蛋白,通過改變蛋白質(zhì)的分子量、電荷分布、表面疏水性、空間結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì),進(jìn)一步增強(qiáng)或改善其功能性質(zhì)[3]。目前,常見的乳清蛋白改性技術(shù)主要集中于物理改性、化學(xué)改性以及酶改性等方面。其中,熱處理、超高壓和超聲波等物理改性技術(shù)主要通過改變?nèi)榍宓鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和分子間作用力來達(dá)到改善其功能特性的目的[4-6];酰化、磷酸化或糖基化等化學(xué)改性技術(shù)主要通過修飾乳清蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)或促進(jìn)二硫鍵的裂解,使表面電荷、空間結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化,從而達(dá)到改善其功能特性的目的[7-9];而酶法改性技術(shù)主要利用特異性酶制劑,誘導(dǎo)乳清蛋白分子的交聯(lián)或水解,從而實現(xiàn)其結(jié)構(gòu)組成和功能特性的改變[10-11]。

近年來,相關(guān)研究表明,由于醇類的極性低于水,可以削弱穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏水相互作用,同時增強(qiáng)靜電相互作用,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的改性[12-13]。Lambrecht等[14]研究發(fā)現(xiàn),利用50%(v/v)乙醇可以促使牛血清白蛋白分子間發(fā)生共價交聯(lián),從而導(dǎo)致蛋白分子發(fā)生聚集。Peng等[15]研究發(fā)現(xiàn),利用乙醇改性處理大豆β-伴球蛋白,能夠顯著誘導(dǎo)蛋白分子的聚集和變性,而且其效果具有乙醇濃度依賴性。然而,雖然相關(guān)研究已經(jīng)證實,乙醇能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)分子的聚集或變性,但是關(guān)于乙醇誘導(dǎo)改性提高乳清蛋白乳化特性,及其相關(guān)機(jī)制方面的研究甚少?；诖?本文利用不同濃度的乙醇(10%、30%、50%和70%,v/v)處理WPI,分析探討乙醇改性處理對WPI的分子結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響,并進(jìn)一步闡明乙醇改性對WPI分子構(gòu)效的影響機(jī)制,以期為改善WPI分子結(jié)構(gòu)以及提高其乳化特性提供新的思路,并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI,蛋白含量90%) 北京銀河路商貿(mào)有限責(zé)任公司;無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris) 北京索萊寶生物科技有限公司;鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉 均為分析純;實驗用水 均為去離子水。

AL-104型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器設(shè)備(上海)有限公司;JD500-2電子天平 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;HJ-6多頭磁力攪拌器 常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司;FE20K型pH計 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司;TU-1800 紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;F-380型熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司;圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司;T18勻漿機(jī) 德國IKA公司;Zetasizer Nano-ZS 型納米粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;5500LS原子力掃描探針顯微鏡 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 用不同濃度的乙醇溶液(10%、30%、50%和70%,v/v)溶解WPI,同時以蒸餾水溶解的WPI作為對照組,將3%(w/v)溶液置于磁力攪拌器在室溫下攪拌4 h。用0.1 mol/L HCl將溶液pH調(diào)至7.0后,將蛋白溶液在室溫下用電風(fēng)扇吹2～3 h去除殘留的乙醇,然后將各樣品凍干得到不同濃度乙醇改性處理的WPI樣品。

在測定改性后WPI的結(jié)構(gòu)特性和功能特性之前,首先測定不同樣品的水分含量,然后用雙蒸水配制成10 mg/mL的溶液,用磁力攪拌器在室溫下攪拌2 h使其充分溶解,然后放置于4 ℃冰箱中12 h使其充分水合備用。

1.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE) 對不同濃度乙醇改性處理的WPI樣品進(jìn)行還原和非還原電泳實驗。將濃度為2 mg/mL的樣品溶液與蛋白溶解液(由0.25 mol/L pH=6.8的Tris-HCl,SDS,溴酚藍(lán)以及甘油配制而成)按1∶1比例混合(還原電泳實驗再添加10%的β-巰基乙醇),在沸水浴中煮3 min,冷卻至室溫備用。分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,開始電泳時電壓為80 V,待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V;電泳結(jié)束后,取出膠片加入染色液染色20 min,之后再用脫色液脫色。

1.2.3 圓二色譜測定 參考Cao等[16]的方法并作適當(dāng)修改,用雙蒸水將樣品稀釋為0.5 mg/mL的待測溶液,將其注入光徑為1 mm的樣品池中,用圓二色譜儀進(jìn)行掃描。以雙蒸水為空白,掃描范圍為190～250 nm,掃描速度為60 nm/min,累積掃描3次。利用圓二色譜Pro軟件分析計算得出樣品中各二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲)的含量。

1.2.4 熒光光譜測定 使用熒光分光光度計對樣品溶液(1 mg/mL)進(jìn)行熒光光譜掃描,測定樣品中色氨酸(Trp)殘基的變化。參數(shù)設(shè)置為:激發(fā)波長295 nm,掃描范圍300～400 nm,掃描速度240 nm/min,狹縫寬度10 nm。

1.2.5 紫外吸收光譜測定 用紫外可見分光光度計對樣品溶液(1 mg/mL)進(jìn)行紫外光譜掃描。參數(shù)設(shè)置為:掃描范圍250～340 nm,掃描速率為中速,采樣間隔為1.0 nm,光徑為1 cm。

1.2.6 原子力顯微鏡觀察 利用原子力顯微鏡觀察樣品的微觀形貌。用雙蒸水將樣品稀釋為1 mg/mL的蛋白溶液,取樣20 μL 滴加在干凈的云母片上,室溫下干燥后選擇輕敲模式進(jìn)行觀察,掃描范圍為2 μm×2 μm,使用NanoScope Analysis進(jìn)行原子力顯微鏡數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 粒徑和電勢測定 用納米粒度及電位分析儀測定不同的WPI樣品溶液(1 mg/mL)的粒徑和ζ-電勢,室溫條件下,每個樣品測量三次。

1.2.8 表面疏水性測定 利用熒光探針ANS法測定樣品的表面疏水性。將每組樣品溶液用雙蒸水稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,吸取每個濃度梯度的蛋白溶液2 mL,分別與20 μL 8 mmol/L的ANS溶液混合,室溫條件下暗反應(yīng)20 min,隨后用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度。測定參數(shù)設(shè)置為:激發(fā)波長390 nm,發(fā)射波長470 nm,狹縫5 nm,掃描速度240 nm/min。以蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),曲線初始段的斜率即代表蛋白的表面疏水性。

1.2.9 乳化特性測定 參考Chen等[17]的方法測定樣品的乳化活性(Emulsification activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(Emulsification stability index,ESI)。將2 mL菜籽油與8 mL WPI溶液(2 mg/mL)混合,用勻漿機(jī)在13500 r/min下勻漿2 min,然后立即從距離管底部0.5 cm處取50 μL新鮮乳狀液加入至含5 mL 0.1% SDS溶液的試管中,振蕩混勻后在500 nm處測定吸光值記作A0,取均質(zhì)10 min后的乳狀液重復(fù)上述步驟記作A10。乳化活性EAI(m2/g)及乳化穩(wěn)定性ESI(%)由以下公式計算得出:

其中,2為2倍;2.303為換算系數(shù);C為蛋白濃度;φ為乳狀液中油相的體積分?jǐn)?shù)(v/v,本實驗的油相體積分?jǐn)?shù)為0.2);L為比色皿光徑(本實驗選用光徑為1 cm的比色皿);104為 cm2和 m2單位之間的換算值;D為稀釋倍數(shù)(本實驗的稀釋倍數(shù)為100);A0、A10分別為乳狀液0和10 min時在500 nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進(jìn)行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE

經(jīng)不同濃度乙醇改性處理的WPI的非還原型(不添加β-巰基乙醇)和還原型(添加β-巰基乙醇)凝膠電泳圖譜如圖1所示。從圖1中可以看出,未經(jīng)處理的WPI在分子量14和17 kDa處有明顯條帶,分別代表α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,且由于WPI中含量較高的是β-乳球蛋白,所以β-乳球蛋白條帶顏色最深。不同濃度乙醇改性處理后,WPI沒有明顯的條帶消失或生成,說明乙醇改性處理沒有改變WPI的蛋白組成。但隨著乙醇濃度的增加,蛋白分子發(fā)生部分聚集,且在凝膠頂部出現(xiàn)大分子量聚集物,而在還原條件下(添加β-巰基乙醇),大分子或中間分子量復(fù)合物發(fā)生解離,則說明蛋白分子之間是通過二硫鍵而形成復(fù)合物,Lambrecht等[14]也報道50%(v/v)濃度的乙醇可顯著導(dǎo)致BSA間形成二硫化物鍵,而Nicolai等[18]也表示二硫鍵在乳清蛋白聚集的形成中起著重要作用。

圖1 不同濃度乙醇改性處理后乳清分離蛋白的非還原和還原凝膠電泳圖譜

2.2 圓二色譜

二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性和功能特性密切相關(guān),圓二色譜已經(jīng)廣泛用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究[19]。如圖2(a)所示為不同濃度乙醇改性處理過的WPI的圓二色譜圖,從圖中可以看出,與對照組相比,處理組的峰形沒有發(fā)生明顯變化,均在195和208 nm附近分別出現(xiàn)一個正峰和一個負(fù)峰,但處理組的色譜圖相比對照組發(fā)生下移,說明乙醇改性處理會對WPI的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。此外,波長208 nm附近的負(fù)峰代表二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋,處理組的摩爾橢圓率[θ]值較對照組高,說明經(jīng)乙醇改性處理后WPI的α-螺旋有所增加。

樣品各二級結(jié)構(gòu)的具體相對含量可以通過圓二色譜Pro軟件分析,分析結(jié)果如圖2(b)所示,由圖可知,對照組的WPI以β-折疊為主,其含量為39.40%,該結(jié)果與單杰等[20]用傅里葉紅外光譜技術(shù)得到的WPI中β-折疊含量達(dá)40.67%相接近。與對照組相比,不同濃度乙醇改性處理的WPI二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量均減少,α-螺旋含量均增加,在乙醇改性處理組中,隨著乙醇濃度的增加,β-折疊含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢,α-螺旋呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,轉(zhuǎn)折點(diǎn)均出現(xiàn)在乙醇濃度為50%的處理組,此時β-折疊和α-螺旋相比對照組分別減少和增加了41.4%和29.4%。類似地,Shiraki等[21]也發(fā)現(xiàn)用乙醇改性處理β-乳球蛋白的過程中伴隨著β-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)化,這可能是因為醇類極性低于水,而低極性的溶液環(huán)境更有利于分子內(nèi)氫鍵的形成,也更容易維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[22]。此外,二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲反映的是蛋白質(zhì)分子的松散程度[23],處理組中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量相比對照組增加,說明一定濃度的乙醇可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松,更有利于改善其乳化性能。

圖2 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的圓二色譜(a)和蛋白二級結(jié)構(gòu)含量(b)的影響

2.3 內(nèi)源性熒光光譜

蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜可以有效反映其三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化情況。圖3所示是不同濃度乙醇改性處理的WPI的內(nèi)源性熒光圖譜,由圖可以看出,與對照組相比,各處理組圖譜形狀均無顯著變化,但處理組的熒光強(qiáng)度值均高于對照組,且隨著乙醇濃度的增加,WPI熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當(dāng)乙醇濃度為50%時熒光強(qiáng)度達(dá)到最大,相比對照組增加了36.90%(P<0.05),內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與蛋白結(jié)構(gòu)中的色氨酸(Trp)密切相關(guān)[24],經(jīng)適當(dāng)濃度乙醇改性處理可以使WPI結(jié)構(gòu)展開,該結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲的分析結(jié)果相吻合。蛋白分子結(jié)構(gòu)展開后,內(nèi)部Trp殘基的暴露導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加,Nor等[25]指出,芳香族氨基酸暴露的增加可以提高蛋白質(zhì)在油水界面的吸附親和力,從而有利于改善其乳化特性。但是當(dāng)乙醇濃度高于50%時,由于部分展開的蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生聚合,導(dǎo)致部分發(fā)色基團(tuán)內(nèi)包于蛋白分子內(nèi)部進(jìn)而發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象,而且由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,發(fā)色基團(tuán)暴露在溶劑中也可能導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[26]。類似的現(xiàn)象在Liu等[27]的研究中也有報道,其發(fā)現(xiàn)用10%～40%的乙醇處理大豆β-伴球蛋白可以使其熒光強(qiáng)度增加,但當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加會發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象。此外,最大發(fā)射波長(λmax)可以作為表示Trp微環(huán)境的重要指標(biāo)[24],處理組與對照組的λmax均大于330 nm,說明Trp殘基位于WPI分子外部的極性環(huán)境當(dāng)中[28-29]。當(dāng)乙醇濃度高于10%時,乙醇改性處理改變了蛋白質(zhì)中Trp殘基所處的微觀環(huán)境,使其趨向極性更強(qiáng)的環(huán)境,因此λmax均顯著紅移(P<0.05),且乙醇濃度為50%時紅移最為顯著,由開始的331.40 nm紅移至334.27 nm(P<0.05)[15]。

圖3 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的內(nèi)源性熒光光譜的影響

表1 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的最大發(fā)射波長的影響

2.4 紫外吸收光譜

圖4 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的紫外吸收光譜的影響

蛋白分子中生色基團(tuán)的分布以及溶液微環(huán)境的不同均會影響其紫外吸收光譜。通常,色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)的最大吸收峰在波長275～280 nm處,苯丙氨酸(Phe)的最大吸收峰在波長257 nm處,因此紫外吸收光譜的變化可以反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[30]。如圖4所示為不同WPI的紫外吸收光譜圖,從圖中可以看出,對照組在280 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰,說明對WPI紫外吸收強(qiáng)度造成影響的是以Trp和Tyr殘基為主。與對照組相比,乙醇改性處理沒有對WPI的最大吸收峰產(chǎn)生顯著影響,但不同乙醇濃度改性處理的WPI最大吸收峰強(qiáng)度均明顯高于對照組,且隨著乙醇濃度的增加,WPI最大吸收峰強(qiáng)度先增加后降低,乙醇濃度為50%時達(dá)到最大,這可能是因為經(jīng)乙醇改性處理的WPI發(fā)生去折疊現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)變得疏松,有更多的Trp和Tyr殘基暴露出來,使得WPI紫外吸收強(qiáng)度增加,但當(dāng)乙醇濃度大于50%時,蛋白分子的氨基酸殘基發(fā)生重組,導(dǎo)致生色基團(tuán)被包埋在分子內(nèi)部,紫外吸收強(qiáng)度減弱[31],該結(jié)果與內(nèi)源性熒光光譜分析結(jié)果相一致。

表2 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的最大紫外吸收波長的影響

2.5 微觀形貌

利用原子力顯微鏡可以在空氣環(huán)境中觀察蛋白質(zhì)的分散和聚集等形態(tài)[32]。如圖5、表3所示為通過Nanoscope軟件分析得到的不同樣品的二維圖像(圖5A)、三維圖像(圖5B)和Rq值(表3),B圖為A圖對應(yīng)的三維圖像,Rq表示蛋白的平均粗糙度,通過它們可以對WPI的表面形態(tài)進(jìn)行一定表征。從A圖和B圖中可以直觀地看出:與對照組相比,處理組的表觀形態(tài)均發(fā)生變化,表面平滑度降低,顆粒明顯,且乙醇濃度為50%時,粒徑更小且分布更為均勻密集,當(dāng)乙醇濃度高于50%時,蛋白相互聚集蛋白形成了聚集體,明顯觀察到了大顆粒聚集物。此外,Rq作為微觀形貌的量化指標(biāo),可以評價蛋白表面形態(tài)水平,當(dāng)乙醇濃度為10%時,處理組的粗糙度增加了15.8%,但與對照組差異不顯著(P>0.05),當(dāng)乙醇濃度大于10%時,由于蛋白結(jié)構(gòu)展開程度增加,處理組的Rq值均顯著增加(P<0.05),且乙醇濃度為50%時,Rq值達(dá)到最大值0.794 nm,當(dāng)乙醇濃度大于50%時,Rq開始減小但仍顯著高于對照組(P<0.05),根據(jù)任曉鋒等[33]研究結(jié)果可知,蛋白質(zhì)的表面粗糙增加,則蛋白質(zhì)的分子表面積增大,可以暴露出更多的功能基團(tuán),對于改善其功能特性有積極作用。

圖5 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的微觀形貌的影響

表3 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白表面平均粗糙度的影響

2.6 粒徑和ζ-電勢

蛋白質(zhì)的聚集程度可以用平均粒徑來表示,而蛋白質(zhì)的ζ-電勢可以表征體系的穩(wěn)定性以及粒子表面帶電荷性質(zhì),與蛋白質(zhì)的平均粒徑也密切聯(lián)系。從圖6可以看出,處理前后的蛋白分子表面均帶負(fù)電荷,表明WPI表面所帶負(fù)電荷多于正電荷,隨著乙醇濃度的增加,蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開,有更多的帶電基團(tuán)暴露出來,分子表面所帶電荷增加,分子間靜電斥力增加,因此蛋白平均粒徑減小,當(dāng)乙醇濃度增加到30%,粒徑達(dá)到最小,乙醇濃度為50%時,蛋白平均粒徑與30%時無顯著差異(P>0.05)。但當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加到70%,分子表面帶電量減小,靜電斥力降低導(dǎo)致蛋白分子相互靠近并發(fā)生相互作用生成聚合物,因此平均粒徑顯著增加(P<0.05)。這種高濃度乙醇條件下發(fā)生的聚集可以從蛋白的微觀形貌(AFM)中明顯觀察得到。

圖6 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白粒徑和ζ-電勢的影響

2.7 表面疏水性

蛋白質(zhì)具有兩親性,其疏水基團(tuán)通常埋藏在蛋白分子內(nèi)部,通過改變蛋白分子構(gòu)象可以使疏水基團(tuán)暴露,疏水相互作用對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和功能特性至關(guān)重要[34]。如表 4所示為不同濃度乙醇改性處理過的WPI表面疏水性的測試結(jié)果。從表4中可以看出,與對照組相比,處理組的表面疏水性均顯著增加(P<0.05),且隨著乙醇濃度的增加,WPI表面疏水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當(dāng)乙醇濃度為50%時處理組的表面疏水性最強(qiáng),高達(dá)8493.00,說明適當(dāng)濃度的乙醇可以使蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開,埋藏在內(nèi)部的疏水性氨基酸(如Trp和Tyr)殘基暴露,增加了熒光探針(ANS)的結(jié)合位點(diǎn),使得蛋白質(zhì)疏水性增強(qiáng),但當(dāng)乙醇濃度超過50%時,過高的乙醇濃度可能會破壞蛋白的疏水區(qū)域,而且蛋白分子表面暴露的疏水基團(tuán)之間可能通過相互作用形成疏水聚集體,將部分疏水基團(tuán)掩蓋,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性降低。類似地,Kundu等[12]在研究乙醇對球蛋白結(jié)構(gòu)的影響時也發(fā)現(xiàn),在適當(dāng)濃度乙醇的存在下,蛋白質(zhì)疏水性相對較高的部分被暴露出來,并指出這可能是由于蛋白質(zhì)表面周圍的電荷密度發(fā)生了變化,也可能是由于蛋白分子之間的相互作用發(fā)生改變。

表4 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白表面疏水性、EAI和ESI的影響

2.8 乳化特性

蛋白質(zhì)的乳化特性通常采用EAI和ESI進(jìn)行表征。EAI指單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)可以吸附脂肪球的區(qū)域面積,ESI表示蛋白質(zhì)維持油水界面穩(wěn)定性的能力[35]。從表 4可以看出,各樣品之間ESI與EAI趨勢一致,處理組的EAI和ESI均顯著高于對照組(P<0.05),且隨著乙醇濃度的增加,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在50%處,此時EAI和ESI均達(dá)到最高,分別為64.48 m2/g和71.10%。結(jié)合之前對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的分析可以知道,一定濃度的乙醇可以將WPI結(jié)構(gòu)打開,使暴露的疏水基團(tuán)數(shù)目增加,更多的蛋白分子吸附到油-水界面,更有利于阻止液滴間的相互碰撞和聚集,因此WPI乳化性能有所提高,但當(dāng)乙醇濃度持續(xù)增加時,生成的蛋白聚合物將部分疏水基團(tuán)掩蓋,導(dǎo)致乳化活力降低,而粒徑較大的蛋白聚合物可能無法有效地覆蓋脂肪滴,導(dǎo)致乳狀液不穩(wěn)定。Peng等[15]研究發(fā)現(xiàn),低濃度乙醇改性處理β-伴球蛋白可以增強(qiáng)其表面疏水性,顯著提高其乳化性能和界面穩(wěn)定性,與本研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本實驗主要針對利用不同濃度的乙醇誘導(dǎo)改性是否能夠打開WPI分子結(jié)構(gòu)以及改善其乳化特性進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙醇改性能夠促使分子結(jié)構(gòu)的展開和重排,使WPI分子表面暴露出更多疏水基團(tuán)并增加分子表面平均粗糙度。同時,高濃度乙醇使WPI分子部分發(fā)生變性還會產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集?；诮Y(jié)構(gòu)的改變,WPI的EAI和ESI得到了顯著的提升,尤其是乙醇濃度為50%時改善效果最為顯著。因此,本實驗為改善WPI的乳化特性提供了有效的策略。