江和棟,李廣焱,牛 仙,萬仁口,陳小露,鄧澤元,李紅艷,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌同心紫巢生物工程有限公司,江西南昌 330052)

靈芝(Ganodermalucidum)是一種珍貴的藥用真菌,為擔(dān)子菌綱,多孔菌科,靈芝屬真菌[1]。靈芝孢子(Ganodermalucidumspores,GLS)為靈芝的生殖細(xì)胞,是靈芝的精華部分,主要有效成分為靈芝三萜、靈芝多糖、有機鍺、腺苷、多肽等,富含豐富的鉀、鈣、鋅等微量元素[2]。靈芝孢子粉具有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì),具有抑制腫瘤、提高免疫力、清除自由基、降血糖、抗氧化、提高機體耐缺氧能力、保護神經(jīng)系統(tǒng)及心肌細(xì)胞等[3]功能。

靈芝孢子具有雙層壁,內(nèi)壁褐色,表面有小疣,外壁光滑透明無色[4]。靈芝孢壁含有52.08%～57.64%的幾丁質(zhì),無機元素主要是 19.01%的硅和 24.31%的鈣,硅和鈣與幾丁質(zhì)的結(jié)合使孢壁更加堅硬和耐酸堿,具有耐高溫、抗酸堿、耐分解、抗消化等性質(zhì),因此很大程度上阻礙了孢子內(nèi)有效成分被充分吸收[5]。由此可見,若要最大程度上利用孢子粉的有效成分,靈芝孢子粉需經(jīng)破壁處理?，F(xiàn)常采用的方法[6]有生物法(如酶解)、物理法(如超聲波和微波)、化學(xué)法(如溶劑浸提)。酶法是通過酶的作用下使靈芝孢子細(xì)胞壁中的成分降解,釋放其有效成分,其具有低能耗、設(shè)備簡單的優(yōu)點,但耗時長、有殘留;化學(xué)法有著較好的提取效率,但同時提取溶劑會導(dǎo)致有效成分變性和溶劑殘留。與其他破壁方法相比,超聲波和微波具有成本更低廉、操作簡單、專一性、反應(yīng)條件溫和、有害殘留低、效率高、對營養(yǎng)活性物質(zhì)破壞少等優(yōu)點[6-7]。本研究選擇超聲法、微波法對孢子粉進行破壁,進一步對破壁前后的靈芝孢子粉物理特性、感官性狀、營養(yǎng)成分的變化狀況進行了分析,以期為孢子粉的安全性,以及相關(guān)靈芝孢子粉系列產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝孢子粉(GLS) 南昌同心紫巢生物科技有限公司提供;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;高氯酸、冰醋酸、硫酸、香草醛 分析純,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;苯酚、福林酚 分析級,上海荔達生物科技有限公司;無水甲醇、無水乙醇 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司。

SJIA-2012 聚能式超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波市雙嘉儀器有限公司;微波爐 廣州格蘭仕有限公司;TDL-5-A高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;BioTek酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市國華電器有限公司;722G可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;AR1140電子分析天平 美國奧豪斯貿(mào)易公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 靈芝孢子粉的超聲處理 稱取干燥后未破壁GLS 5 g至500 mL具塞三角瓶中,分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加水,設(shè)定超聲功率500 W,溫度70 ℃,超聲提取15 min;在液料比20∶1,溫度70 ℃,超聲功率分別為200、300、400、500、600 W條件下超聲15 min;在液料比20∶1,超聲功率400 W,溫度70 ℃,超聲時間分別為10、15、20、25、30 min的條件下超聲。處理完后將GLS干燥。

1.2.1.2 靈芝孢子粉的微波處理 稱取干燥處理后的未破壁GLS 5 g至500 mL具塞三角瓶中,在微波功率420 W,分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的條件下加水微波60 s;在料液比20∶1,微波功率分別為140、280、420、560、700 W的條件下微波處理30 s;在液料比20∶1,微波功率420 W的條件下進行微波輻射處理30、60、90、120、150 s。處理完后將GLS干燥。

1.2.2 多糖和三萜的測定及得率的計算 稱取5 g干燥處理后的GLS,經(jīng)90%乙醇脫脂2 h,無水乙醇洗滌,55 ℃干燥24 h。取適量脫脂粉末,熱浴水提,離心(4200 r/min,10 min)取上清液,真空濃縮至適量,加4倍無水乙醇沉淀,4 ℃靜置過夜,離心(4200 r/min,10 min)去上清,將沉淀加水定容搖勻,以苯酚-硫酸法[8]顯色在490 nm下測定吸光度,以葡萄糖為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算多糖含量。

式中:W為樣品中多糖含量,%;M1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含糖量,μg;V1為樣品的定容體積,mL;V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積,mL;M2為樣品質(zhì)量,g;0.9為校正系數(shù)校正糖的微克數(shù)。

稱取5 g干燥GLS置于500 mL燒瓶中加100 mL氯仿置水浴中加熱,回流2 h,冷卻至室溫,將提取液離心取上清液,55 ℃真空濃縮去除氯仿,用甲醇溶解并定容搖勻,以香草醛-冰醋酸法[9]顯色在546 nm下測定吸光度,以齊墩果酸為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算三萜含量。

式中:W為樣品中三萜含量,%;C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中三萜含量,μg;V1為樣品的定容體積,mL;V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積,mL;M為樣品質(zhì)量,g。

1.2.3 感官性狀與物理性質(zhì) 通過人對孢子粉末進行聞、嘗的方式評定氣味和滋味;取適量微波破壁后的GLS分別測定粒度[10]、松緊密度[11]、比表面積[12]、色度、休止角[13]。具體為,粒度:稱取200 mg,加入蒸餾水50 mL,超聲(560 W，40 kHz)5 min,再利用激光粒度測定儀測試樣品粒徑;比表面積:采用比表面積儀測定;色度:取GLS填滿2/3樣品皿,直接讀取分光測色儀顯示色度值(L*值、a*值、b*值);比表面積:將大孔漏斗固定于鐵架臺上,正下方放入A4紙,將微膠囊粉末緩慢均勻地從漏斗上方倒入正下方白紙上,直至所堆積錐體高度不再增高,測定椎體的底面半徑及高度,測定休止角公式如下:

式中:θ為休止角;H為物種錐體的高度,cm;R為物種錐體水平底面的半徑,cm。

1.2.4 電鏡觀測 取適量GLS樣品,用導(dǎo)電膠粘著于金屬樣品臺上鍍導(dǎo)電膜,在加速電壓15 kV,在5000倍、1500倍、500倍條件下觀察、拍照[14]。

1.2.5 成分測定 水分:《GB 5009.3-2010》食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分測定方法;灰分:《GB 5009.4-2010》食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分測定方法;多酚:《T/AHFIA 005-2018》植物提取物及其制品中總多酚含量的測定;總脂肪:《GB/T 14772-2008》食品中粗脂肪的測定;蛋白質(zhì):《GB 5009.6-2010》食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)測定方法。

1.2.6 紅外光譜分析 分別稱取少量干燥破壁和未破壁GLS置于研缽中,加入適量溴化鉀充分研磨,壓片,于傅立葉紅外儀上400～4000 cm-1的范圍內(nèi)掃描 32 次,分辨率為 4 cm-1[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD,n=3)。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析,方差分析(ANOVA)用于顯著性分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲、微波破壁對多糖和三萜含量的影響

2.1.1 超聲處理對靈芝孢子粉多糖和三萜含量的影響 由圖1可知,采用超聲對GLS進行破壁,可明顯提高多糖、三萜的溶出率。靈芝孢子藥理活性與多種活性物質(zhì)密切相關(guān),其中多糖和三萜化合物被認(rèn)為是其主要藥理活性成分。超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高加速度、攪拌作用和強烈的空化效應(yīng)[16-17],將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破碎或溶解,可加速物料中的成分進入溶劑,加速多糖、三萜等有效成分的溶出[18-19]。圖1a表示當(dāng)液料比由10∶1 (mL/g)持續(xù)增加到20∶1 (mL/g)時,多糖和三萜的含量呈現(xiàn)上升的趨勢,三萜到達峰值,當(dāng)液料比繼續(xù)增加到25∶1 (mL/g),多糖含量達到最高。考慮到節(jié)約能源和增加溶劑使得后續(xù)干燥工藝難度加大,且多糖含量變化不顯著，因此,選取液料比20∶1 (mL/g)較合適。如圖1b,在超聲處理15 min的條件下,超聲功率400 W時，多糖和三萜含量顯著高于其他水平(P<0.05)。當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加，兩者含量持續(xù)下降,這可能是由于超聲功率過大破壞了多糖和三萜的結(jié)構(gòu)[20],使得其含量減少,故超聲功率400 W為宜。由圖1c可知,在固定超聲功率為400 W的條件下,隨著超聲時間的增加,多糖和三萜含量呈快速上升的趨勢,于25 min,多糖含量到達最高值,之后略有下降;三萜含量趨于平緩,另外過長的浸泡和超聲時間可能會導(dǎo)致多糖分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致提取率降低[21-22]。結(jié)合實驗結(jié)果,超聲破壁選擇料液比為20∶1 (mL/g)、超聲功率400 W、超聲時間25 min。在此條件下多糖含量為1.418%±0.032%，三萜含量為3.51%±0.23%。

圖1 料液比、超聲功率、超聲時間對多糖和三萜含量的影響

2.1.2 微波破壁對多糖和三萜含量的影響 由圖2可知,采用微波對GLS進行破壁,可明顯提高多糖、三萜的溶出率。微波的內(nèi)外同時加熱效應(yīng)、強穿透性能使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速升高,產(chǎn)生高壓導(dǎo)致細(xì)胞破裂,促進胞內(nèi)組分流出,多糖、三萜的含量升高[23-25]。由圖2a可知,當(dāng)液料比由10∶1 (mL/g)持續(xù)增加到15∶1 (mL/g)時,多糖和三萜的含量呈現(xiàn)上升的趨勢；于液料比15∶1 (mL/g)時，三萜達到峰值；當(dāng)液料比繼續(xù)增加到20∶1 (mL/g),多糖含量達到最高。由于液料比對多糖溶出的影響大于對三萜的影響,因此,料液比應(yīng)控制在20∶1 (mL/g)左右比較合適。圖2b顯示在微波處理30 s的條件下,隨著微波功率140 W增長到700 W多糖和三萜含量呈先上升后下降的趨勢,三萜含量于280 W達到峰值,多糖含量于420 W達到峰值。隨后,微波功率繼續(xù)增加兩者含量反而下降,這是由于微波提升物料內(nèi)部溫度從而使多糖加速溶出。但功率過大會阻礙介質(zhì)滲入,另外微波會導(dǎo)致提取液溫度過高,從而可能導(dǎo)致多糖和三萜的分解,使得含量下降[26-28]。多糖含量隨著功率從140 W開始快速上升,當(dāng)?shù)竭_280 W增速趨于平緩,穩(wěn)中略升,并于420 W到達峰值?？紤]到能耗和對多糖、三萜結(jié)構(gòu)的保護,選擇280 W為最佳功率。由圖2c可知,在固定微波功率420 W的條件下,隨著微波時間30 s延長到150 s,多糖和三萜含量呈先上升后下降的趨勢,并在90 s時多糖和三萜含量同時到達峰值。微波作用可能會降低反應(yīng)的活化能,促使多糖和三萜發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致提取率下降[29-30]。綜上,采用微波破壁時,選擇料液比20∶1 (mL/g),微波功率280 W,微波時間90 s。由于微波破壁處理后的GLS具有較高含量的多糖和三萜化合物,故采用微波破壁后的GLS作為后續(xù)實驗原料。

圖2 料液比、微波功率、微波時間對多糖和三萜含量的影響

2.2 感官性狀分析

從表1可以看出,破壁GLS的感官狀態(tài)與未破壁GLS差異顯著。破壁前樣品為淡褐色細(xì)粉末,手搓有明顯滑膩感,較為松散,在白板上流動性比較好,而破壁后的GLS內(nèi)脂溶出,顏色較深,呈深棕褐色,稍有茹附性,易吸潮,不能飛散。這些都可以從粒度、休止角、松緊密度的變化中可以看出,其中孢子的比表面積通過破壁增長了149%,粒徑減小了55.75%,休止角增大了10.44%,松緊密度分別增大了60.56%、91.59%,說明破壁效果明顯[12]。滋味方面,破壁后的GLS比破壁前味道更為苦澀,油膩感更強,且在口腔中更潤滑。這是由于GLS中的苦味物質(zhì)主要是三萜類靈芝酸在破壁之后更加容易溶出[31]。氣味方面,GLS具有特有的香味,類似杏香味。此外破壁后GLS含有大量不飽和脂肪酸,易氧化,所以長時間存放可能略泛油嵩味。綜上,破壁處理使GLS的比表面積、松緊密度、色度均明顯增加,粒度、流動性減小,促進了GLS內(nèi)容物的釋放。

表1 破壁前后靈芝孢子粉感官性狀

2.3 顯微形貌觀測

未破壁靈芝孢子細(xì)胞一般呈瓜子形[32]。從圖3a、c、e可以看出,未破壁GLS的形態(tài)完整,可以明顯地看到孢子雙層孢壁結(jié)構(gòu),呈中空狀,其顯微結(jié)構(gòu)可見長軸約 11 μm,短軸約 7～8 μm,細(xì)胞壁厚度為 1～2 μm。孢子表面有許多小孔,每個孢子表面都有一處凸起的小圓形物,有一面凹陷,頂端一個小圓形凹坑,底端卵圓形,這是因為組成GLS細(xì)胞壁的聚糖鏈上所存在的肽鍵數(shù)量多,交聯(lián)程度緊密致使結(jié)構(gòu)十分致密,導(dǎo)致強度很高,采用物理手段破壞十分困難。經(jīng)破壁處理后,可以看到破壁后的孢子頭部已打開,內(nèi)壁具有明顯小刺電鏡下可以看到,被粉碎為最小粒徑小于1 μm、最大粒徑為6～7 μm的微粒,其破壁率大于95%,十分有利于GLS細(xì)胞內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)的快速釋放和人體的充分吸收。由于內(nèi)容物的滲出,孢子表層的小孔被覆蓋,不規(guī)則的片狀堆疊呈層狀,孢子碎片的雜亂堆積,破壁GLS呈不規(guī)則團塊狀結(jié)構(gòu)。由此得出,GLS經(jīng)破壁后形態(tài)有明顯變化。

圖3 破壁和未破壁靈芝孢子在不同倍數(shù)下的SEM圖

2.4 營養(yǎng)成分分析

從圖4可以看出,破壁后脂肪、總?cè)圃龇畲?多糖、灰分次之;蛋白質(zhì)和總多酚最低。一般來講,經(jīng)過破壁后的GLS中脂肪、多糖、三萜、灰分和蛋白質(zhì)的含量會有不同程度地提高。這說明破壁后GLS的營養(yǎng)成分更容易溶出。營養(yǎng)成分中脂肪的增幅最大,這可能與孢壁的成分和性質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān),靈芝孢壁是由不溶于水的多糖類高分子構(gòu)成,分別是葡聚糖、幾丁質(zhì)等,具有耐高溫、抗酸堿、耐分解、抗消化等性質(zhì),因此很大程度上阻礙了孢子內(nèi)有效成分的充分溶出,這樣在用有機溶劑提取脂肪時,孢壁就阻礙了有機溶劑向孢子粉內(nèi)部浸入,使內(nèi)部的脂肪無法浸提出來[33-35]。但破壁后孢壁被打破,內(nèi)容物充分暴露,有效物質(zhì)釋放更徹底[36]。

圖4 靈芝孢子粉在破壁前后的營養(yǎng)成分分析

2.5 紅外光譜分析

由文獻可知,破壁GLS和未破壁GLS的譜圖在峰形、峰數(shù)、峰位有較高程度的一致性[36]。由圖5可知,在3500～3200 cm-1處有寬面強的吸收峰,這是GLS的甾醇類、多糖類、三萜類化合物的羥基O-H的伸縮振動和蛋白質(zhì)氨基酸中的酰胺類N-H伸縮振動而引起的;在3010 cm-1附近有一弱吸收峰,在2920、2850 cm-1處有較強尖峰,是甲基-CH3和亞甲基CH2的C-H 伸縮振動吸收峰[37];在1740 cm-1附近有強吸收峰,是脂肪酸中的C=O伸縮振動,說明脂肪酸含量較高;在1630 cm-1有中等強度的吸收峰,為酰胺Ⅰ鍵的特征峰,在1530 cm-1附近處有弱吸收峰,為酰胺Ⅱ鍵的特征峰,說明有氨基酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì);在1370、1260 cm-1附近有吸收峰,在1150和 1060 cm-1處有強吸收峰,這是中糖環(huán)內(nèi)酯C-O-C強極性吸收峰。

圖5 破壁前后靈芝孢子粉的紅外光譜分析

從光譜可以看出,破壁前和破壁后的GLS紅外譜圖譜帶的位置、數(shù)目、形狀基本上沒有發(fā)生變化,可以初步認(rèn)為,破壁前后GLS有效成分沒有發(fā)生變化[38]。此外,破壁后的GLS在1730 cm-1處增加了一個較小的尖銳的吸收峰。1730 cm-1處主要是羰基的吸收峰,這可能是由于破壁后,孢子粉內(nèi)容物溶出,其中的甘油三酯和三萜類靈芝酸都含有羰基,判斷可能是這部分物質(zhì)的吸收峰[39]。

3 結(jié)論

本實驗以GLS為原料,采用微波對其破壁,以多糖和三萜含量為評價指標(biāo)得到最佳破壁工藝為:料液比20∶1 (mL/g)、微波功率280 W、微波時間90 s。對微波破壁后的靈芝孢子粉品質(zhì)進一步研究,破壁后的GLS物理性質(zhì)發(fā)生了明顯變化:比表面積、松緊密度、色度均明顯增加;粒度、流動性有所減小。電鏡觀測顯示,孢子完整形態(tài)被破壞,靈芝孢子呈瓜子形狀、緊密的雙層孢壁結(jié)構(gòu)變成不規(guī)則的片狀堆疊呈層狀,孢子碎片的雜亂堆積,呈不規(guī)則團塊狀。結(jié)果表明,微波對GLS進行破壁極大地促進了其有效成分釋放,破壁后總脂肪、總多糖、總?cè)啤⒒曳?、蛋白質(zhì)、多酚等功能成分的含量均有不同程度的增加。Ding等[40]通過對靈芝多糖的體內(nèi)外消化發(fā)酵中,發(fā)現(xiàn)未能直接被吸收的多糖可在結(jié)腸中被微生物發(fā)酵利用,產(chǎn)生短鏈脂肪酸,降低pH,從而調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境,改善腸道健康?；诖搜芯?微波破壁可促進多糖的釋放進一步增加結(jié)腸微生物對多糖的利用。此外,由于破壁后增加了三萜類、油脂物質(zhì)的溶出，會導(dǎo)致口感略帶苦味和油膩感,可以考慮加入食品添加劑改善口感,或采用微膠囊技術(shù)重塑孢壁。本研究可為GLS的品質(zhì)鑒定提供理論支持和進一步開發(fā)新型保健品提供理論指導(dǎo)。