劉靜雯，黃 亮，班立桐，孫 寧，王 玉，楊 艷

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

靈芝（Ganoderma lucidum）作為一種名貴中藥用于臨床已有悠久的歷史，具有扶正固本[1]、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗腫瘤[2]、抗放射、提高免疫力的功效。近年來關(guān)于靈芝產(chǎn)漆酶的研究越來越多[3]，與動物來源的漆酶相比，真菌漆酶具有更好的熱穩(wěn)定性、更強(qiáng)的金屬耐受性及底物催化活性[4]。

與固體菌種相比，靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)周期短、工藝簡便[5]。金屬元素對真菌細(xì)胞生長、次生代謝產(chǎn)物合成具有顯著影響。李宇偉等[6]研究表明，0．2%的Fe2+對提高靈芝多糖含量有明顯效果。鮑銳等[7]研究結(jié)果表明，加入100μmol·L-1硫酸銅時，靈芝酸產(chǎn)量較對照組提高57%。蔡愛群等[8]發(fā)現(xiàn)在濃度為200 mg·L-1～1 200 mg·L-1時，隨著 Ca2+濃度的增加，赤芝的生物量逐漸減少。

通過對靈芝菌株泰山靈芝G8的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，考察 Fe2+、Cu2+、K+、Mg2+、Ca2+對菌株 G8 液體培養(yǎng)過程中產(chǎn)漆酶的影響，為靈芝的資源開發(fā)利用提供參考，促進(jìn)藥用真菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌種

靈芝菌株泰山靈芝G8（以下簡稱菌株G8），保藏于天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

1.2 培養(yǎng)基

液體菌種培養(yǎng)基：KH2PO40.46 g、K2HPO41 g、玉米粉1%、葡萄糖20 g、酵母浸粉15 g。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲生長曲線的測定。

接種后靜置1 d，然后置于25℃、140 r·min-1的搖床培養(yǎng)。于第3天開始每天取樣，記錄菌絲干重。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制菌絲生長曲線，并根據(jù)生長曲線測定取樣時間。

1.3.2 菌種培養(yǎng)條件篩選

1）靜置時間對菌株G8液體培養(yǎng)速率的影響

在轉(zhuǎn)速140 r·min-1條件下，設(shè)置不同靜置時間梯度，依次為 0、8 h、16 h、24 h、32 h。培養(yǎng)7 d后，測定菌絲體干重。

2）不同裝液量對菌株G8生長速率的影響

在轉(zhuǎn)速140 r·min-1、靜置時間24 h條件下，采用250 mL三角瓶進(jìn)行試驗，設(shè)置不同裝液量梯度，依次為 50 mL、70 mL、90 mL、100 mL、110 mL。培養(yǎng)7 d后測定菌絲體干重。

3）不同pH對菌株G8生長速率的影響

在轉(zhuǎn)速為140 r·min-1、靜置時間24 h、裝液量90 mL條件下，設(shè)置不同pH梯度，依次為4、5、6、7、8，培養(yǎng)7 d后，測定菌絲體干重。

1.3.3 單因素試驗

培養(yǎng)基中添加不同濃度的礦質(zhì)元素，分別為FeSO4：0、0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1；CuSO4：0、0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.15 g·L-1；KCl：0、0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.20 g·L-1；MgSO4：0、0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、2.0 g·L-1；CaCO3：0、0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1。

每個處理3次重復(fù)試驗。于25℃靜置24 h，pH 5，裝液量90mL，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1的條件下培養(yǎng)靈芝G8菌絲，第7天取樣測定漆酶的吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素篩選試驗以KCl、CuSO4、CaCO3、MgSO4為因素，設(shè)計L9（34）的正交試驗，正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計Tab.1 Factors and levels design of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌絲生長曲線

菌株G8菌絲生長情況見圖1。

圖1 菌株G8生長曲線Fig.1 Growth curve of strain G8

如圖1所示，根據(jù)泰山靈芝G8菌絲生長曲線,確定最佳取樣時間為第7天。

2.2 靜置時間對靈芝液體培養(yǎng)速率的影響

不同靜置時間對菌株G8液體培養(yǎng)速率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同靜置時間條件下菌絲干重Fig.2 The dry weightofmycelium under different standing time conditions

由圖2可知，隨著靜置時間的延長，菌絲干重先升高后降低。靜置時間為24 h的搖瓶中菌絲干重最大為2.33 g·L-1，因此根據(jù)試驗結(jié)果確定靜置時間為24 h時最佳。

2.3 裝液量對靈芝生長的影響

不同裝液量對菌株G8生長的影響試驗結(jié)果見圖3。

圖3 不同裝液量條件下菌絲干重Fig.3 The dry weightofmycelium under different liquid medium volume conditions

由圖3可知，隨著裝液量的增加，菌絲干重呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)裝液量為90 mL時搖瓶中溶氧量高，菌絲代謝旺盛，菌絲干重達(dá)到最大；但裝液量過大時反而影響搖瓶中的溶氧量，從而導(dǎo)致菌絲生長緩慢。因此最佳裝液量為90mL。

2.4 pH條件對靈芝生長的影響

pH影響菌絲體的新陳代謝，從而影響菌絲生物量的高低[9]，不同pH對菌株G8生長的影響試驗結(jié)果見圖4。

圖4 不同pH條件下菌絲干重Fig.4 The dry weightofmycelium under different pH conditions

由圖4可知，隨著pH的增加，菌絲干重呈先升高后降低的趨勢。pH為5時菌絲干重達(dá)到6.864 g·L-1，顯著高于其他處理；pH為6時搖瓶中菌絲干重顯著下降，這與姚良同等[10]試驗結(jié)果相同。故篩選出的最佳pH為5。

2.5 礦質(zhì)元素對漆酶酶活性的影響

MgSO4、CaCO3、FeSO4、CuSO4和 KCl對漆酶酶活性的影響單因素試驗結(jié)果見圖5～圖9。

圖5 MgSO4對漆酶酶活的影響Fig.5 EffectofMgSO4 on laccase activity

圖6 CaCO3對漆酶酶活的影響Fig.6 Effectof CaCO3 on laccase activity

圖7 FeSO4對漆酶酶活的影響Fig．7 Effectof FeSO4 on laccase activity

圖8 CuSO4對漆酶酶活的影響Fig．8 Effectof CuSO4 on laccase activity

圖9 KCl對漆酶酶活的影響Fig．9 Effectof KCl on laccase activity

如圖5～圖9所示，漆酶酶活在MgSO4添加量為0．5 g·L-1時最大；漆酶酶活隨CaCO3添加量增加而提高，在添加量達(dá)到0．2 g·L-1時達(dá)最大值；漆酶酶活隨著Fe2+濃度的增加逐漸降低，說明Fe2+對靈芝漆酶酶活性有抑制作用，這與沈柯宇[11]的研究結(jié)果相同；漆酶酶活在CuSO4添加量為0．1 g·L-1時達(dá)到最大值；K+對漆酶酶活具有一定的激活作用[12]，漆酶酶活在KCl添加量為0．05 g·L-1時達(dá)到最大值。

2.6 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗R值的大小反映該因子對試驗結(jié)果的影響程度，分析結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果分析Tab．2 Analysis of orthogonal test results

如表2所示，正式試驗影響試驗結(jié)果的各因素順序為：MgSO4>KCl>CaCO3>CuSO4。最佳組合為A3B3C2D2， 即 為 KCl 0．1 g·L-1、 CuSO40．15 g·L-1、CaCO30．2 g·L-1、MgSO40．5 g·L-1。

正交試驗結(jié)果的方差分析見表3。

表3 正交試驗方差分析表Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

如表3所示，結(jié)果表明KCl、MgSO4對菌株G8液體培養(yǎng)漆酶酶活性具有顯著性差異。

2.7 驗證試驗結(jié)果分析

驗證試驗結(jié)果表明，菌株G8液體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的酶活最佳培養(yǎng)基配方為A3B3C2D2，即90 mL培養(yǎng)基添加礦質(zhì)元素含量為 KCl 0．1 g·L-1、CuSO30．15 g·L-1、CaCO30．2 g·L-1、MgSO40．5 g·L-1，漆酶的酶活為72．28 U·L-1。

3 結(jié)論與討論

靜置時間對靈芝生長有一定影響，不靜置與靜置16 h和24 h之間的差異也較明顯。不同裝液量對菌株G8的生長影響相對較小，裝液量100mL的菌絲干重低于裝液量50 mL，裝液量的多少直接影響溶氧水平[13]，不同濃度氧氣條件下菌絲干重變化同樣受到影響[14]；在低于100 ml裝液量時，靈芝的生長情況隨裝液量的增加而提高；在裝液量為90 mL時菌絲干重達(dá)到最大值，與慕春歌等[15]最佳裝液量為120mL的研究結(jié)果不同，其差異性可能是由于菌種與液體培養(yǎng)基成分的不同所引起。不同pH對菌株G8的生長情況影響較大，當(dāng)pH為5時與菌株G8生長曲線相比，菌絲干重提高了近50%，由此得出菌株G8為偏酸性菌。

已有研究報道發(fā)現(xiàn)，靈芝菌株產(chǎn)漆酶能力與培養(yǎng)條件存在一定關(guān)聯(lián)[16]，優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源、添加外源物質(zhì)等，均會對靈芝菌株漆酶活性產(chǎn)生影響[17-18]，不同的礦質(zhì)元素作為外源物質(zhì)對靈芝漆酶酶活產(chǎn)生的影響不同，且礦質(zhì)元素對漆酶活性的影響與其離子濃度有關(guān)，礦質(zhì)元素不僅可以增加漆酶的表達(dá)量，還可以提高其活性。在本研究中，5種礦質(zhì)元素不同程度的增加或抑制了靈芝漆酶的活性。將單因素試驗與正交試驗相結(jié)合，篩選出最佳產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基礦質(zhì)元素添加量為KCl 0.1 g·L-1，CuSO40.15 g·L-1，CaCO30.2 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，此時漆酶活力最高值為72.28 U·L-1，與優(yōu)化前相比提高了28%。

在工廠規(guī)?；a(chǎn)中，主要靠發(fā)酵罐實現(xiàn)液體菌種的培養(yǎng)。通過搖瓶培養(yǎng)確定了可供參考的菌株G8生產(chǎn)的液體培養(yǎng)及產(chǎn)漆酶條件，而發(fā)酵罐和搖瓶的培養(yǎng)條件差異較大，且礦質(zhì)元素種類眾多，不同的礦質(zhì)元素對漆酶活性的影響效果不一致，因此還需進(jìn)一步開展發(fā)酵罐培養(yǎng)條件與其他礦質(zhì)元素對漆酶酶活的影響試驗研究。