楊 麗，曾 娟，吳正云*，蘇艷秋，張文學(xué)

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.通威股份有限公司，四川 成都 610041）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)嬰幼兒大腦和視力的發(fā)育，預(yù)防和治療心血管疾病，防治癌癥，治療精神失調(diào)，防治肥胖，防治關(guān)節(jié)炎等重要生理功能[1-3]。DHA的普遍來源是魚油，但是魚油具有不良的魚腥味，且魚油中常含有二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），高含量的EPA不適用于嬰幼兒奶粉[4]。而微生物來源的DHA因為具有含量高、質(zhì)量好、過程可控、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。

裂殖壺藻（Schizochytriumsp.）因為具有胞內(nèi)DHA含量高、生長快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為工業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想菌株之一[5]。裂殖壺藻胞內(nèi)的不飽和脂肪酸除DHA外還伴隨著一定量的二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA），但DPA不像EPA，對膳食中的DHA功效無阻擾作用[6]。近年來，裂殖壺菌已成為DHA產(chǎn)業(yè)化的研究熱點(diǎn)，但是目前國內(nèi)外對裂殖壺藻的研究主要集中在誘變高產(chǎn)菌株以及發(fā)酵條件對DHA產(chǎn)量的影響上，而對探討DHA合成過程中所涉及到的脂肪酸流量分配問題探討的研究還較少。本研究利用一株Schizochytriumsp.A3-9，采用均勻設(shè)計試驗探究初始葡萄糖含量、碳氮比、裝液量及檸檬酸、蘋果酸和生物素等外源添加物對其發(fā)酵過程中脂肪酸代謝合成規(guī)律的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)中提高裂殖壺菌胞內(nèi)DHA含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

裂殖壺藻（Schizochytriumsp.）A3-9：由成都通威水產(chǎn)科技公司提供原始菌株，經(jīng)常壓室溫等離子體（atmospheric androomtemperatureplasma，ARTP）誘變后由實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿干粉：上海金穗生物科技有限公司；海鹽：山東省萊州市康興源鹽化有限公司；葡萄糖、瓊脂粉、47%三氟化硼乙醚、甲醇、三氯甲烷、正己烷、氯化鈉、氫氧化鉀、無水硫酸鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨1g/L，海鹽15 g/L，瓊脂粉17 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，海鹽15 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

初始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，玉米漿干粉15g/L，酵母膏 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，海鹽 15 g/L，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 SE氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；LRHS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HZQX100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；FA2004B電子天平：上海天美天平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌株活化：將保存于實驗室-80℃冰箱的菌種劃線接于固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接于裝液量為50mL/250mL液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)24h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）接種量取種子液接種于裝液量為100 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)試驗分3批次進(jìn)行，共計40組實驗數(shù)據(jù)，分別在28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察因素包括：初始葡萄糖含量（40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L）、裝液量（60 mL/500 mL、80 mL/500 mL、100 mL/500 mL、120mL/500mL、140mL/500mL、160mL/500mL、180mL/500mL、200 mL/500 mL、220 mL/500 mL）、碳氮比（8、11、14、17、20、23、26、29、32），并添加了檸檬酸（0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L）、蘋果酸（0、0.2 g/L、0.4g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L）和生物素（0、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L）3種外源添加物，同時以初始培養(yǎng)條件（初始葡萄糖含量為50g/L，裝液量為100mL/500mL，碳氮比為12.5，不添加外源添加物，28℃、180r/min培養(yǎng)48h）作為對照組。

上述所有試驗組碳氮比的調(diào)節(jié)是通過改變原始發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿干粉的添加量（0～28.84 g/L），而酵母膏和蛋白胨添加量則與初始葡萄糖含量保持一定比值；3種外源添加物均是在裂殖壺藻發(fā)酵24 h后通過無菌過濾添加。

1.3.2 分析檢測

（1）生物量測定

發(fā)酵液生物量測定方法參考文獻(xiàn)[2]。

（2）脂肪酸含量的測定

油脂的提取及甲酯化方法參考文獻(xiàn)[7]。油脂經(jīng)三氟化硼催化法甲酯化后利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS）法檢測。

氣相色譜條件：RTX-5silMS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為高純度氦氣（He），壓力105.8 kPa，總流量37.1 mL/min，柱流量1.1 mL/min，線速度40.0 cm/s，吹掃流量3.0 mL/min，分流比30∶1，柱溫采取程序升溫，初始溫度為160℃，保持2 min，以10℃/min升至190℃，保持2 min，以30℃/min升至220℃，保持15 min，總程序時間33 min，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230℃，接口溫度250℃，溶劑延遲時間3 min，質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z，全掃描方式。

脂肪酸定性定量方法：參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用SAS軟件，以初始葡萄糖含量、碳氮比、裝液量及3種外源添加物的添加量為自變量，以生物量、總脂肪酸含量、不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的流量分配比及DHA與DPA的流量分配比為因變量，采用逐步回歸分析建立回歸方程。為使不同考察因素之間具有可比性，將各因素的取值進(jìn)行歸一化處理（即分別將各因素的最低取值設(shè)為0，最高取值設(shè)為1，中間取值按比例映射到0～1之間）。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖壺藻生物量影響因子的回歸分析

40組試驗數(shù)據(jù)的生物量范圍為5.13～38.20 g/L，對照組生物量為18.63 g/L。以初始葡萄糖含量（X葡萄糖）、碳氮比（X碳氮比）、裝液量（X裝液量）及3種外源添加物（X檸檬酸、X蘋果酸、X生物素）的添加量為自變量，以裂殖壺藻生物量（Y1）為因變量，采用逐步回歸分析，得到回歸方程：

根據(jù)回歸方程，僅提示生物量與初始葡萄糖含量及碳氮比有關(guān)，未得到生物量與裝液量及3種外源添加物添加量之間的相關(guān)性，這可能是由于在試驗組取值范圍內(nèi)，裝液量及3種外源添加物添加量改變對生物量影響較小，被初始葡萄糖含量及碳氮比改變帶來的影響掩蓋。由回歸系數(shù)看，生物量與初始葡萄糖含量一次項回歸系數(shù)為正，與碳氮比一次項回歸系數(shù)為負(fù)，說明當(dāng)X葡萄糖取1（即初始葡萄糖含量為90 g/L），X碳氮比取0（即碳氮比為8）時，最有利于生物量積累，這是因為細(xì)胞生長需要充足的碳源和氮源，因此，初始碳源和氮源含量越多，積累的生物量就越多[12]。

根據(jù)回歸方程計算，預(yù)測生物量可達(dá)最大值為36.94g/L，此時初始葡萄糖含量90 g/L，碳氮比8，對裝液量及3種外源添加物添加量無要求。對該生物量優(yōu)化條件進(jìn)行3次發(fā)酵驗證試驗，驗證試驗中裝液量與3種外源添加物添加量與對照組保持一致，最終得到生物量平均值為38.12 g/L，比對照組提高了104.59%，證明了增加初始葡萄糖含量，降低碳氮比有利于生物量積累。

2.2 裂殖壺藻總脂肪酸含量影響因子的回歸分析

對照組總脂肪酸含量為33.62 g/100 g藻粉，40組試驗數(shù)據(jù)中總脂肪酸含量范圍為9.98～50.70 g/100 g藻粉。以初始葡萄糖含量（X葡萄糖）、碳氮比（X碳氮比）、裝液量（X裝液量）及3種外源添加物（X檸檬酸、X蘋果酸、X生物素）的添加量為自變量，以藻粉中的總脂肪酸含量（Y2）為因變量，采用逐步回歸分析，得到回歸方程：

根據(jù)回歸方程可知，總脂肪酸含量與碳氮比、裝液量及檸檬酸添加量有關(guān)，未得到總脂肪酸含量與初始葡萄糖含量、蘋果酸和生物素添加量之間的相關(guān)性，這可能是由于在試驗組取值范圍內(nèi)，初始葡萄糖含量及蘋果酸和生物素添加量的改變對總脂肪酸含量的影響較小，被掩蓋。回歸方程中，與裝液量有關(guān)的項僅有一項，且回歸系數(shù)為正，說明在試驗范圍內(nèi)（裝液量60～220 mL/500 mL），總脂肪酸含量隨著裝液量的增加而增加，即溶氧越低越有利于裂殖壺藻胞內(nèi)總脂肪酸的積累；回歸方程中與檸檬酸有關(guān)的項也僅有一項，且回歸系數(shù)為正，說明在試驗范圍內(nèi)（檸檬酸添加量0～1.6 g/L），總脂肪酸含量隨著檸檬酸添加量的增加而增加，這可能是因為檸檬酸裂解酶催化檸檬酸裂解反應(yīng)是脂肪酸合成所需乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，Co A）的來源[8]；回歸方程中，碳氮比的二次項回歸系數(shù)為負(fù)，一次項回歸系數(shù)為正，說明在試驗范圍內(nèi)（碳氮比8～32），總脂肪酸含量隨碳氮比的增大呈先增加后減少的趨勢，這是因為當(dāng)培養(yǎng)基中氮源耗盡時，產(chǎn)油微生物會接到此信號并作出反應(yīng)，不斷增加胞內(nèi)腺嘌呤核糖核苷酸（adeno sine monophosphate，AMP）脫氨酶的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AMP的濃度不斷降低，異檸檬酸脫氫酶活性減弱甚至完全停止，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)油微生物線粒體內(nèi)檸檬酸大量積累，為維持胞內(nèi)環(huán)境的平衡，蘋果酸/檸檬酸轉(zhuǎn)移酶將過量的檸檬酸釋放到線粒體外，然后在檸檬酸裂解酶的作用下將其裂解生成乙酰輔酶A和草酰乙酸，生成的乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）途徑或者聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）途徑進(jìn)一步合成各種微生物油脂[10]，提高碳氮比可以使裂殖壺藻提前進(jìn)入油脂積累，利于脂肪酸的合成，但是氮源是細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)，碳氮比過高會打破裂殖壺藻的代謝平衡，反而不利于油脂積累；回歸方程中，碳氮比與檸檬酸和裝液量的交互項回歸系數(shù)均為正，說明裝液量與碳氮比及檸檬酸添加量與碳氮比對總脂肪酸的積累有協(xié)同促進(jìn)作用，具體原因還有待深入研究。

根據(jù)回歸方程計算，當(dāng)X碳氮比取0.625，X裝液量取1，X檸檬酸取1時，預(yù)測總脂肪酸含量可達(dá)最大值52.14 g/100 g藻粉，此時碳氮比取23，裝液量取220 mL/500 mL，檸檬酸添加量取1.6 g/L，對初始葡萄糖含量及蘋果酸、生物素添加量無要求。對該總脂肪酸含量優(yōu)化條件進(jìn)行3次發(fā)酵驗證試驗，驗證試驗中初始葡萄糖含量及蘋果酸、生物素添加量與對照組保持一致，最終得到總脂肪酸含量平均值為47.16 g/100 g藻粉，雖然未達(dá)到預(yù)測值，但是相比對照組提高了40.25%，提升效果顯著，證明了適當(dāng)增加碳氮比，增加裝液量（即降低溶氧）、添加檸檬酸有利于總脂肪酸積累。

2.3 裂殖壺藻脂肪酸代謝影響因子的分析

通過GC-MS對藻粉中脂肪酸進(jìn)行檢測，總離子流色譜圖見圖1，各脂肪酸鑒定結(jié)果見表1。由圖1可知，除內(nèi)標(biāo)物十三烷酸外，共檢測出7種脂肪酸，包括十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸五種飽和脂肪酸以及二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）兩種不飽和脂肪酸。

圖1 裂殖壺藻A3-9中脂肪酸GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of fatty acid inSchizochytriumsp.A3-9 analysis by GC-MS

表1 裂殖壺藻A3-9中脂肪酸組成GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of fatty acid composition inSchizochytriumsp.A3-9 by GC-MS

如表1所示，裂殖壺藻A3-9中十六烷酸和DHA含量最豐富，在40組發(fā)酵試驗中，十六烷酸含量范圍為2.67～23.38 g/100 g藻粉，DHA含量范圍為4.63～17.94 g/100 g藻粉，除此之外，DPA的含量也較為豐富，含量范圍為0.86～3.19 g/100 g藻粉，而十四烷酸、十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸含量均較低。

研究表明，裂殖壺藻在發(fā)酵過程中有兩條脂肪酸合成途徑：傳統(tǒng)的FAS合成途徑和PKS合成途徑（見圖2）[10]。十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸五種飽和脂肪酸由FAS途徑合成[4]，而DPA和DHA兩種不飽和脂肪酸由PKS途徑合成[6，11]。PKS途徑中DPA和DHA并不是前體與產(chǎn)物之間的關(guān)系，但是由于DPA在PKS途徑中的代謝過程尚不明確，故將DPA與DHA代謝途徑發(fā)生改變的節(jié)點(diǎn)用未知代謝物表示。

圖2 裂殖壺藻A3-9胞內(nèi)脂肪酸代謝流量圖Fig.2 Metabolic flow chart of fatty acid in the cell of Schizochytriumsp.A3-9

如圖2所示，脂肪酸的前體物質(zhì)乙酰輔酶A在合成DHA的過程中發(fā)生過兩次分流，一次是在反-2-己烯脂酰ACP節(jié)點(diǎn)處，一部分前體物質(zhì)進(jìn)入PKS途徑合成不飽和脂肪酸，一部分進(jìn)入FAS途徑合成飽和脂肪酸；另一次是在PKS途徑中的某一中間產(chǎn)物，一部分最終合成ω-3系列不飽和脂肪酸DHA，而另一部分最終合成ω-6系列不飽和脂肪酸DPA。因此，在前體物質(zhì)總量一定的情況下，促進(jìn)其更多的進(jìn)入PKS途徑（即提高r1/r2的比值），并在PKS途徑中更多合成DHA（即提高r3/r4的比值），是提高裂殖壺藻胞內(nèi)DHA含量的新思路。

2.3.1 不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸流量分配影響因子的回歸分析

根據(jù)40組試驗數(shù)據(jù)計算，反-2-己烯脂酰分支節(jié)點(diǎn)處不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的流量分配比r1/r2變化范圍為0.46～1.11，對照組為0.948 2。以初始葡萄糖含量（X葡萄糖）、碳氮比（X碳氮比）、裝液量（X裝液量）及3種外源添加物（X檸檬酸、X蘋果酸、X生物素）的添加量為自變量，以r1/r2（Y3）為因變量，采用逐步回歸分析，得到回歸方程：

根據(jù)回歸方程，提示r1/r2與初始葡萄糖含量、碳氮比、裝液量及檸檬酸和蘋果酸添加量均有關(guān)，未得到與生物素添加量之間的相關(guān)性，這可能是由于生物素是乙酰輔酶A羧化酶的載體，而乙酰輔酶A羧化酶是乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A的限速酶，不參與后續(xù)脂肪酸合成，因此不會影響PKS途徑與FAS途徑之間的流量分配，也不會影響后續(xù)DHA與DPA之間的流量分配。回歸方程中，與葡萄糖和檸檬酸有關(guān)的項各有一項，且回歸系數(shù)均為正，說明增加初始葡萄糖濃度和檸檬酸添加量會促進(jìn)反-2-己烯脂酰ACP進(jìn)入PKS途徑合成不飽和脂肪酸；回歸方程中與裝液量有關(guān)的項也僅有一項，且回歸系數(shù)為負(fù)，說明降低裝液量，即增加溶氧可以促進(jìn)反-2-己烯脂酰ACP進(jìn)入PKS途徑合成不飽和脂肪酸；回歸方程中與碳氮比有關(guān)的項有兩項，且回歸系數(shù)均為負(fù)，說明降低碳氮比可以促進(jìn)反-2-己烯脂酰ACP進(jìn)入PKS途徑合成不飽和脂肪酸?；貧w方程中蘋果酸與檸檬酸交互項為正，與碳氮比交互項為負(fù)，說明當(dāng)碳氮比較低，檸檬酸添加量較高時，增加蘋果酸添加量可以促進(jìn)反-2-己烯脂酰ACP流入PKS途徑。

根據(jù)回歸方程計算，當(dāng)X碳氮比和X裝液量取0，X葡萄糖、X檸檬酸和X蘋果酸取1時，預(yù)測r1/r2可達(dá)最大值1.50，此時初始葡萄糖含量90 g/L，碳氮比8，裝液量60 mL/500 mL，檸檬酸和蘋果酸添加量1.6 g/L。對該條件進(jìn)行3次發(fā)酵驗證試驗，驗證試驗中生物素添加量與對照組保持一致，最終得到r1/r2平均值為1.15，雖然未達(dá)到預(yù)測值，但是相比對照組提高了21.28%，有一定提升效果。

2.3.2 DPA與DHA流量分配影響因子的回歸分析

根據(jù)40組試驗數(shù)據(jù)計算，DHA與DPA流量分配比r3/r4變化范圍為4.13～7.11，對照組為6.62。以初始葡萄糖含量（X葡萄糖）、碳氮比（X碳氮比）、裝液量（X裝液量）及3種外源添加物（X檸檬酸、X蘋果酸、X生物素）的添加量為自變量，以r3/r4（Y4）為因變量，采用逐步回歸分析，得到回歸方程：

根據(jù)回歸方程可知，r3/r4與碳氮比、裝液量及蘋果酸添加量均有關(guān)，未得到與初始葡萄糖含量及檸檬酸與生物素添加量之間的相關(guān)性，其可能原因同上?；貧w方程中，與裝液量有關(guān)的項僅有一項，且回歸系數(shù)為正，說明隨著裝液量的增加，不飽和脂肪酸中DHA所占比重會增加；回歸方程中與蘋果酸有關(guān)的項有兩項，且均為負(fù)，說明隨著蘋果酸添加量的增加，DHA在不飽和脂肪酸中的比重會下降；回歸方程中碳氮比的二次項及其與蘋果酸的交互項回歸系數(shù)為負(fù)，而碳氮比與裝液量的交互項回歸系數(shù)為正，總體來看，隨著碳氮比的增加，不飽和脂肪酸中DHA所占比重會降低。

根據(jù)回歸方程計算，當(dāng)X碳氮比取0.28，X裝液量取1，X蘋果酸取0時，r3/r4預(yù)測可達(dá)最大值6.75，此時碳氮比14.75，裝液量220 mL/500 mL，蘋果酸添加量0 g/L。對該條件進(jìn)行3次發(fā)酵驗證試驗，驗證試驗中初始葡萄糖含量及檸檬酸和生物素添加量與對照組保持一致，最終得到r3/r4平均值為6.82，相比對照組提高了3.02%，有一定提升效果，證明了降低溶氧并適當(dāng)提高碳氮比可以提高DHA在不飽和脂肪酸中所占比重。

3 結(jié)論

在裂殖壺藻搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程中，其生物量主要受培養(yǎng)基初始葡萄糖含量和碳氮比的影響，初始葡萄糖含量90 g/L，碳氮比8時最有利于生物量積累，此時生物量可達(dá)38.12 g/L，較對照組提高了104.59%。裂殖壺藻細(xì)胞中總脂肪酸含量隨著檸檬酸添加量和裝液量的增加而增加，而隨著碳氮比的增加，總脂肪酸含量呈先增加后降低趨勢，裝液量220 mL/500 mL，碳氮比23，檸檬酸添加量1.6 g/L時總脂肪酸的積累可達(dá)47.16 g/100 g藻粉，相比對照組提高了40.25%。當(dāng)初始葡萄糖含量90 g/L，碳氮比8，裝液量60 mL/500 mL，檸檬酸和蘋果酸添加量1.6 mg/L時，PKS途徑對底物的競爭優(yōu)勢最強(qiáng)，推測可能在這些條件下異構(gòu)酶活性更強(qiáng)；而當(dāng)碳氮比取14.75，裝液量取220 mL/500 mL時可以提高DHA在PKS途徑產(chǎn)物中的比重。