譚延肖 鄭現(xiàn)和 石 瑩 趙文超 馬鋒旺 劉長(zhǎng)海，*

(1 德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 德州 253015；2 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)是生物體內(nèi)特異性與半胱氨酸蛋白酶結(jié)合，并抑制其活性的一類(lèi)蛋白[1]。它們通?？梢耘c木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性中心結(jié)合，抑制其催化活性，或者與酶的變構(gòu)部位結(jié)合成緊密的復(fù)合物，阻止酶原轉(zhuǎn)化成有活性的酶，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的降解[2-3]。Cystatin在生物體內(nèi)廣泛存在，在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和植物中均有報(bào)道[4]。Abe 等[5]在1987年首次從水稻種子中克隆到cystatin基因的植物同源物，隨后在小麥、馬鈴薯等80多個(gè)物種中成功克隆和鑒定到cystatin基因[6]。

在植物中，cystatin參與調(diào)控植株發(fā)育、種子萌發(fā)、葉片衰老及細(xì)胞程序性死亡等生物學(xué)過(guò)程[7-9]。此外，cystatin也參與植物對(duì)干旱、高鹽、極端溫度等環(huán)境脅迫的響應(yīng)[10-13]。近年來(lái)，一些研究也發(fā)現(xiàn)，cystatin在植物應(yīng)對(duì)害蟲(chóng)和某些病原菌引起的生物脅迫過(guò)程中也發(fā)揮了非常重要的作用[14]。Haq 等[15]將原核表達(dá)的cystatin蛋白通過(guò)體外飼喂有害昆蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)其體重明顯下降，生長(zhǎng)明顯受到抑制。同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段將水稻等的cystatin基因?qū)敫收嶂参矬w內(nèi)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)線蟲(chóng)、豆象等有害昆蟲(chóng)的侵襲有顯著抗性[16-17]。Roby等[18]觀察到西瓜感染菜豆炭疽菌(Colletotrichumlagenarium)后，葉片內(nèi)的tin蛋白含量會(huì)上升。將植物cystatin體外純化蛋白添加到培養(yǎng)植物病原真菌的培養(yǎng)基中，病原真菌的孢子萌發(fā)及菌絲體生長(zhǎng)均受到明顯抑制[19-22]。

蘋(píng)果(Malusdomestica)是世界上栽植面積最大的果樹(shù)之一。我國(guó)蘋(píng)果栽植面積和產(chǎn)量均居世界首位，但其往往受到干旱、高鹽、極端溫度及病蟲(chóng)害等不良外界環(huán)境的制約[23-24]。本研究前期在蘋(píng)果屬楸子(M.prunifolia)葉片中克隆到一個(gè)cystatin基因MpCYS4(GenBank登錄號(hào)：KF477275)[25]，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其在蘋(píng)果矮化砧木M26中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)后可以提高植株對(duì)干旱脅迫的抗性[26]。本研究以MpCYS4過(guò)表達(dá)株系為試驗(yàn)材料，探索MpCYS4基因在蘋(píng)果響應(yīng)褐斑病病原菌侵染過(guò)程中的功能，鑒定過(guò)表達(dá)株系材料的抗病性，同時(shí)，對(duì)MpCYS4融合蛋白進(jìn)行體外誘導(dǎo)純化和抑菌活性分析，以期為進(jìn)一步揭示蘋(píng)果MpCYS4基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為蘋(píng)果抗逆育種提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以蘋(píng)果矮化砧木M26野生型(WT)和MpCYS4過(guò)表達(dá)株系#1、#3、#4為試驗(yàn)材料[26]，栽植于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)溫室內(nèi)(34°20′N(xiāo)，108°24′E)。

供試菌株：子囊菌門(mén)蘋(píng)果盤(pán)二孢DiplocarponmaliY. Harada & Sawamura。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果褐斑病病菌(Diplocarponmali)分離與接種 蘋(píng)果褐斑病病菌分離純化：參考殷麗華[27]的方法，在田間收集有單一典型癥狀且?guī)в蟹稚咦颖P(pán)的蘋(píng)果褐斑病病葉，將其置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)2～3 d，待產(chǎn)生白色分生孢子時(shí)，于顯微鏡下根據(jù)孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定病原菌[28]，接種針挑取，用無(wú)菌水配制1×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液。用接種環(huán)接種少量孢子懸浮液于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。待病原菌生長(zhǎng)為直徑約1 cm的菌落后，鏡檢，并挑取邊緣少量菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行二次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。如此經(jīng)過(guò)3～4 次轉(zhuǎn)接后，可使菌種得到純化。每次轉(zhuǎn)接前，需對(duì)菌落形態(tài)和顏色進(jìn)行觀察，同時(shí)鏡檢，確認(rèn)為蘋(píng)果褐斑病菌。

病原菌回接鑒定：在抗性鑒定之前，為確保分離得到的是蘋(píng)果褐斑病病原菌，采用噴霧法將分離純化的孢子懸浮液接種于田間采集的蘋(píng)果健康葉片，10片為一組，重復(fù)3次。置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

蘋(píng)果褐斑病抗性鑒定：田間采集從底部數(shù)第9～第12葉位完全展開(kāi)、生長(zhǎng)健康的M26野生型和轉(zhuǎn)基因株系葉片，無(wú)菌水沖洗葉表面。將葉柄在無(wú)菌水中剪去末端，脫脂棉包裹，葉片晾干后，接種20 μL分生孢子懸浮液，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)，10 d后調(diào)查發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。根據(jù)發(fā)病程度制定5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[27]：0 級(jí)：無(wú)病害癥狀；1 級(jí)：病斑面積≤10%；2 級(jí)：10%<病斑面積≤30%；3 級(jí)：30%<病斑面積≤50%；4 級(jí)：50%<病斑面積≤75%；5 級(jí)：病斑面積>75%。

發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100%

(1)

病情指數(shù)(disease index，DI)=Σ(病級(jí)葉片數(shù)×該級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高發(fā)病級(jí)代表值)×100%

(2)。

1.2.2MpCYS4基因表達(dá)分析 蘋(píng)果M26野生型葉片在接種病原菌后0、2、4、6、8 d分別取樣，于-80℃保存，用于RNA提取，以非接種病毒菌葉片為對(duì)照。MpCYS4基因表達(dá)水平通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)[26]。以MpActin為內(nèi)參基因，每5個(gè)處理葉片混合為一個(gè)RNA樣本，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 MpCYS4融合蛋白純化及活力測(cè)定 MpCYS4融合蛋白誘導(dǎo)及純化參考Tan等[26]的方法。將構(gòu)建的pET-32a-MpCYS4表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含100 mg·L-1氨芐青霉素(Amp)的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后以1∶100重新接種，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為0.1 mmol· L-1，16℃下誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察融合蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)Ni-NTA親和層析法進(jìn)行蛋白純化,純化后蛋白濃度測(cè)定使用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)sigma公司)進(jìn)行。

將200 μL 1 mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液、l mL 0.5 mol· L-1磷酸二氫鈉溶液加入離心管中，37℃條件下靜置3 min；試驗(yàn)組加入1 mL含有0、5、10、20、30 μg·mL-1的MpCYS4重組蛋白溶液，對(duì)照組加入相應(yīng)濃度pET-32a空載體蛋白，37℃下靜置4 min，然后分別加入500 μL 1 mg·mL-1苯甲?；?L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺(benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide)作為底物，37℃條件下反應(yīng)20 min，用20%乙酸終止反應(yīng)。用UV-2550分光光度計(jì)(日本SHIMHDZU公司)分別測(cè)定405 nm處的吸光值，確定半胱氨酸蛋白酶的相對(duì)活性[29]。

1.2.4 MpCYS4蛋白體外抑菌活性分析 將蘋(píng)果褐斑病病菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)[30]，在無(wú)菌水中分離純化孢子，并將其濃度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1。 將50 μL孢子懸浮液加入10 mL PCDA液體培養(yǎng)基中，分別加入0、10、20、30、40、50 μg·mL-1體外純化的MpCYS4融合蛋白，25℃振蕩培養(yǎng)24 h，以50 μg·mL-1PET-32a空載體蛋白為對(duì)照。在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，分析蘋(píng)果褐斑病病菌的生長(zhǎng)差異[31]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各試驗(yàn)處理均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Sigma Plot軟件作圖，并應(yīng)用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對(duì)變量進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MpCYS4基因?qū)μO(píng)果褐斑病病原菌侵染誘導(dǎo)的響應(yīng)

在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)接種褐斑病病原菌的M26葉片進(jìn)行取樣，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MpCYS4的表達(dá)水平。由圖1可知，接種病原菌2 d后，MpCYS4基因表達(dá)水平迅速上升到最高值，4～8 d后其表達(dá)水平持續(xù)下降。以噴布無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照，在檢測(cè)過(guò)程中MpCYS4基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明MpCYS4的表達(dá)明顯受到蘋(píng)果褐斑病病原菌的誘導(dǎo)。

注：**、***分別表示在0.01、0.001水平上差異顯著。下同。Note：** indicates significant difference at 0.01 level, *** indicates significant difference at 0.001 level. The same as following.圖1 蘋(píng)果MpCYS4對(duì)蘋(píng)果褐斑病的響應(yīng)Fig.1 The response of apple MpCYS4 to Diplocarpon mali infection

2.2 蘋(píng)果MpCYS4基因過(guò)表達(dá)株系葉片抗性鑒定

在抗性鑒定前，將分離純化得到的病原菌，對(duì)田間蘋(píng)果健康葉片進(jìn)行了回接鑒定。接種7 d后接種點(diǎn)出現(xiàn)病斑，與田間自然發(fā)病的癥狀相似。通過(guò)對(duì)接種葉片的再分離、培養(yǎng)形狀和病原形態(tài)學(xué)觀察，接種病原菌的發(fā)病葉片均再次分離得到與接種菌一致的菌，證明回接菌株是蘋(píng)果褐斑病病原菌。

隨后，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因M26蘋(píng)果葉片進(jìn)行了抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)病菌接種10 d后，野生型葉片褐色病斑多且連接成片，而轉(zhuǎn)基因株系葉片病斑數(shù)量明顯較少、發(fā)病情況明顯較輕(圖2)。發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)顯示，接種10 d后，野生型葉片接種點(diǎn)的發(fā)病率達(dá)到90%，轉(zhuǎn)基因葉片僅為60%～70%。此外，轉(zhuǎn)基因接種葉片的病情指數(shù)也顯著低于野生型植株(圖3)。綜上說(shuō)明，MpCYS4過(guò)量表達(dá)顯著提高了蘋(píng)果葉片對(duì)褐斑病的抗性。

圖2 褐斑病接種10 d后野生型和MpCYS4轉(zhuǎn)基因株系(#1、#3、#4)葉片發(fā)病情況Fig.2 Phenotypes of apple leaves (wild-type and transgenic line #1，#3，and #4) after inoculation with Diplocarpon mali for 10 days

2.3 MpCYS4融合蛋白誘導(dǎo)及活力分析

為確定MpCYS4融合蛋白的活性，以木瓜蛋白酶為底物進(jìn)行體外試驗(yàn)。由圖4-A、 B可知，純化得到的MpCYS4目的蛋白純度較好，對(duì)木瓜蛋白酶的活力具有明顯的抑制效果，且這種抑制效應(yīng)隨著反應(yīng)體系中MpCYS4蛋白含量的增加而增強(qiáng)。

2.4 MpCYS4融合蛋白抑菌活性分析

由圖5-A、B可知，加入空載體pET-32a的蛋白粗提液與不加任何蛋白的褐斑病病菌生長(zhǎng)結(jié)果相似，OD492基本相等；加入MpCYS4融合蛋白的褐斑病培養(yǎng)液OD492明顯小于對(duì)照。且隨著MpCYS4蛋白濃度增加，OD492減小，抑菌活性增強(qiáng)。上述結(jié)果初步顯示，MpCYS4融合蛋白對(duì)蘋(píng)果褐斑病具有一定的生長(zhǎng)抑制作用。

圖3 褐斑病接種10 d后野生型和MpCYS4轉(zhuǎn)基因株系(#1，#3，#4)葉片發(fā)病率及病情指數(shù)Fig.3 Incidence and disease index of apple leaves (wild-type and transgenic line #1，#3，and #4) after inoculation with Diplocarpon mali for 10 days

注：1：純化的MpCYS4-His融合蛋白；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12 h的總可溶性蛋白；3：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總可溶性蛋白。Note: 1: Purified recombinant MpCYS-His fusion protein. 2: Total soluble protein fraction after 12 h of IPTG induction. 3: Total soluble protein fraction without IPTG induction.圖4 MpCYS4融合蛋白對(duì)半胱氨酸蛋白酶活性的抑制效應(yīng)Fig.4 Inhibition of MpCYS4 fusion protein on cysteine proteinase activity

圖5 MpCYS4融合蛋白對(duì)蘋(píng)果褐斑病菌的抑制活性Fig.5 Antifungal activity of MpCYS4 recombinant protein to Diplocarpon mali

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在植物對(duì)害蟲(chóng)和某些病原菌的侵染防御響應(yīng)中cystatin發(fā)揮著重要的作用，它們通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶活性和蛋白質(zhì)代謝，保護(hù)細(xì)胞、組織及器官中的蛋白質(zhì)免受來(lái)自病原微生物和昆蟲(chóng)等外源蛋白水解酶的水解，參與一系列生理病理反應(yīng)過(guò)程，形成生物體免疫系統(tǒng)的重要組分[32]。有報(bào)道稱(chēng)cystatin可抑制鱗翅目、鞘翅目等有害昆蟲(chóng)消化道內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的活性，擾亂其體內(nèi)的正常代謝，最終導(dǎo)致發(fā)育不正常而死亡[33]。植物cystatin抗蟲(chóng)作用機(jī)制的研究報(bào)道較多，但對(duì)其抗病功能機(jī)制的研究還很缺乏[21, 32]。

本研究結(jié)果表明，褐斑病病原菌侵染可誘導(dǎo)MpCYS4基因的表達(dá)顯著上調(diào)。在M26中過(guò)量表達(dá)，離體葉片接種褐斑病病菌后，轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比發(fā)病情況明顯減輕。將MpCYS4體外純化蛋白添加在培養(yǎng)褐斑病病原真菌的培養(yǎng)基中，病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，這與前人報(bào)道的一致[19-22]。表明蘋(píng)果MpCYS4基因參與其對(duì)褐斑病病菌的防御反應(yīng)，且具有抑制蘋(píng)果褐斑病病菌生長(zhǎng)的作用，但相關(guān)的作用機(jī)理仍有待深入研究。

有研究者認(rèn)為，病原微生物需要依賴胞外蛋白酶降解寄主組織，以獲得其生長(zhǎng)和增殖所需的氨基酸，實(shí)現(xiàn)其侵染與擴(kuò)展。而植物則可能通過(guò)分泌蛋白酶抑制劑阻止病原菌蛋白酶對(duì)寄主組織的降解，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)不足，生長(zhǎng)和增殖受限，達(dá)到抗病的目的[34]。也有報(bào)道表明，cystatin對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的抑制作用與病原菌體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的活性并無(wú)直接關(guān)系，可能通過(guò)影響真菌細(xì)胞壁的形成或者改變細(xì)胞膜的通透性，影響病原真菌的生長(zhǎng)[35]。因此，cystatin在植物抗病反應(yīng)中的相關(guān)作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究表明，蘋(píng)果MpCYS4基因的表達(dá)受褐斑病病原菌侵染的誘導(dǎo)，在蘋(píng)果矮化砧木M26中過(guò)量表達(dá)MpCYS4明顯提高了葉片對(duì)褐斑病的抗性。將MpCYS4體外純化蛋白添加在培養(yǎng)褐斑病病原菌的培養(yǎng)基中，病原菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均受到明顯抑制。本研究為進(jìn)一步探究MPCYS4的生物學(xué)功能及其抗病作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為蘋(píng)果抗逆育種提供了新的理論依據(jù)。