徐琴琴 陳衛(wèi)良 毛碧增,*

(1 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2 農(nóng)業(yè)部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058)

立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)屬半知菌亞門絲核菌屬(Rhizoctonia)，根據(jù)菌絲融合情況被劃分為14個融合群(anastomosis groups，AGs)，即AG-1～AG-13和AG-BI，大多數(shù)類群為植物病原真菌，可引起病害[1-2]。

立枯絲核菌不產(chǎn)生無性孢子，常以菌絲或菌核的形態(tài)在土壤中或寄主殘體上越冬[3]，其寄主范圍廣、危害大，可侵染水稻、馬鈴薯、大豆、玉米、小麥和煙草等260多種植物[4-5]。據(jù)報道每年因立枯絲核菌侵染所引起的水稻紋枯病造成水稻產(chǎn)量減少10%～30%，在華南、江南、長江流域及江淮稻區(qū)水稻減產(chǎn)最為嚴重，高達50%左右[6]；玉米紋枯病一般發(fā)病率為70%～100%，造成減產(chǎn)損失10%～20%，嚴重時高達35%[7]；馬鈴薯黑痣病在各馬鈴薯種植區(qū)都有不同程度的發(fā)生，特別是在東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)病率高達70%～80%[8]。因此，如何有效防控立枯絲核菌的侵染與發(fā)展已成為國內(nèi)外十分關(guān)注的問題。諸多學(xué)者通過轉(zhuǎn)化葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶[9-11]等外源基因來創(chuàng)制紋枯病抗性育種材料，但由于立枯絲核菌寄主范圍廣、腐生性強，一直都難以尋找到理想抗源，育種進程漫長?；谥参铩≡プ鞯臋C理，立枯絲核菌的致病機理成為研究熱點，大量研究表明，立枯絲核菌致病的主要因子為毒素和細胞壁降解酶[12-14]。本文從立枯絲核菌毒素提取工藝的發(fā)展、成分鑒定、生物活性及致病機理進行綜述，旨在為立枯絲核菌的深入研究和有效防治提供一定的理論依據(jù)。

1 立枯絲核菌毒素提取工藝的發(fā)展

自1933年首次報道菊池鏈格孢菌毒素以來，植物病原真菌毒素受到越來越多學(xué)者關(guān)注，至今已對鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternania)、長蠕孢屬(Helminthospo)等進行了系統(tǒng)的研究[15-17]。真菌毒素即真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的次級代謝物，能夠染污幾乎所有種類的食用、飼用農(nóng)產(chǎn)品以及中草藥等嚴重危害人畜健康[17]。大多數(shù)病原真菌采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌絲生長緊密成團、收集濾液方法來提取毒素，但不同病原真菌適宜培養(yǎng)基及產(chǎn)毒條件不同。

在立枯絲核菌培養(yǎng)液選擇方面，1963年，Aoki等[18]首次采用稻葉培養(yǎng)液培養(yǎng)立枯絲核菌并提取獲得了立枯絲核菌毒素。此后，康霄文等[19]和徐敬友等[20]采用不同培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件對立枯絲核菌進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)利用pH值7的改良Richard培養(yǎng)液，在25～30℃黑暗條件下培養(yǎng)15 d，每隔8 h人工振蕩1次的條件下產(chǎn)生的毒素對水稻胚根生長抑制率最高(89%)。此外，張正禹等[14]采用待立枯絲核菌菌絲長滿培養(yǎng)基并產(chǎn)生大量菌核后，將菌絲及培養(yǎng)基切成小塊進行浸泡的方法來提取毒素；Aliferis等[21]直接對菌核成熟過程化合物進行分析鑒定。綜上表明，獲取立枯絲核菌毒素通常采用Richard培養(yǎng)液培養(yǎng)的方法，Richard培養(yǎng)液營養(yǎng)成分簡單，用于毒素的分離純化具有優(yōu)勢，但Richard培養(yǎng)液組分與植物組織成分存在較大的差異，故用其培養(yǎng)立枯絲核菌獲得的毒素成分及含量與該病原菌在寄主上產(chǎn)生的毒素成分及含量可能有一定的差異。在毒素濃縮純化方面，Xu等[22]、陳夕軍等[23]和Frederick等[24]主要采取乙酸乙酯萃取法、真空濃縮法、活性炭吸附法、酸度調(diào)節(jié)萃取法、乙醚萃取法和活性炭吸附萃取等方法對毒素進行濃縮提純，發(fā)現(xiàn)通過乙醚萃取法所得的立枯絲核菌毒素的毒性最強。

2 立枯絲核菌毒素的成分鑒定

真菌代謝物的成分主要包括多糖、糖肽、酚類、雜環(huán)化合物、氨基酸衍生物、類萜化合物以及脂類化合物等[25]。早期由于毒理學(xué)研究技術(shù)的限制，真菌毒素的研究不全面，主要集中在黃曲霉毒素、鏈格孢毒素、長蠕孢毒素和鐮刀菌毒素[15-16, 26-27]。迄今為止，立枯絲核菌毒素的成分尚無明確定論，大多認為其成分為羧酸及衍生物或者糖類及糖胺。

2.1 羧酸及衍生物

1962年，Aoki等[18]從甜菜中分離到2株立枯絲核菌菌株，代謝物成分為乳酸(圖1-A)、丁二酸(圖1-B)、苯乙酸(圖1-C)、2-呋喃甲酸(圖1-D)和間羥基苯乙酸(圖1-E)。1980年，Mandava等[28]從大豆中分離出AG1-IA 亞群菌株，代謝物成分為羧酸及衍生物，并首次發(fā)現(xiàn)了新化合物成分間甲氧基苯乙酸(圖1-F)，還通過高效液相色譜法定量分析了羧酸及衍生物含量。

近年來隨著光譜和色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，立枯絲核菌代謝物成分鑒定越來越精確。2015年，Xu等[22]通過電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectometry，ESI-MS)、高分辨電噴霧質(zhì)譜(high resolution electrospray ionization mass spectometry，HR-ESI-MS)、核磁共振氫譜(1Hnuclear magnetic resonance，1H NMR)和核磁共振碳譜(13Cnuclear magnetic resonance，13C NMR)等方法，發(fā)現(xiàn)分離于水稻的立枯絲核菌菌株產(chǎn)生的次生代謝物包含了8種化合物，其中，間-羥基苯基乙酸甲酯(圖1-H)、(Z)-3-甲基戊-2-烯-1,5-二酸(圖1-I)和3-甲氧基呋喃-2-羧酸(圖1-G)首次被鑒定出。

2016年，F(xiàn)rederick等[24,29]從馬鈴薯中分離到屬于立枯絲核菌融合群AG-3中菌株，應(yīng)用高效液相色譜(high performance liquid choromatography，HPLC)和核磁共振質(zhì)譜(nuclear magnetic resonance，NMR)技術(shù)對其發(fā)酵液進行分析，鑒定出3-甲硫基丙酸(3-Methylthiopropionic acid，3-MTPA)(圖1-J)和3-甲硫基丙烯酸(3-Methylthioacrylic acid，3-MTAA)(圖1-K)2種新成分。傅立葉轉(zhuǎn)紅外光譜(fourier tansform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)結(jié)果顯示，其主要官能團包括2 962.1(-CH3)、1 465.6(-CH2-)、1 727.9(C=O)、1 729.8(-COOH)和1 124.3 cm-1(-OH)。

Hu等[30-31]采用超效液相色譜四極飛行時間質(zhì)譜分析(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)技術(shù)對立枯絲核菌AG1-IA亞群3個菌株菌核成熟過程中代謝物進行分析，首次在菌絲體中鑒定出細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)(圖1-L)。研究表明，細交鏈孢菌酮酸是一種天然植物毒素劑，已被證明是一種新型的光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑[30-31]。

注：A：乳酸；B：丁二酸；C：苯乙酸；D：2-呋喃甲酸；E：間羥基苯乙酸；F：間甲氧基苯乙酸；G：3-甲氧基呋喃-2-羧酸；H：間-羥基苯基乙酸甲酯；I：(Z)-3-甲基戊-2-烯-1,5二酸；J：3-甲硫基丙酸；K：3-甲硫基丙烯酸；L：細交鏈孢菌酮酸。注：A：Lactic acid. B：Succinic acid. C：Phenylacetic acid. D：2-Furoic acid. E：M-hydroxyphenylacetic acid. F：M-methoxyphenylacetic acid. G：3-methoxyfuran-2-carboxylic acid. H：Methyl m-hydroxyphenyl acetate. I：(Z)-3-methylpent-2-en-1,5-dioic acid. J：3-Methylthiopropionic acid. K：3-Methylthioacrylic acid. L：Tenuazonic acid.圖1 立枯絲核菌羧酸及衍生物類代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of carboxylic acids and and derivatives metabolites from Rhizoctonia solani

2.2 糖類及糖胺

糖類及糖胺的研究始于1997年，Vidhyasekaran等[32]從水稻上分離到立枯絲核菌株，其組分含甘露糖、葡萄糖和N-乙酰基葡萄糖。2001年，Sriram等[33]研究發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌毒素為一類含葡萄糖、甘露糖和N-乙酰半乳糖胺的糖類及糖胺類混合物。近年來，陳夕軍等[23]對立枯絲核菌毒素進行HPLC、薄層層析(thin layer chromatography，TLC)、紅外光譜(infrared spectrometer，IR)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas choromatography mass spectrometry，GC-MS)分析，發(fā)現(xiàn)其包含葡萄糖、蔗糖和N-乙酰氨基甘露糖。Yang等[34]認為立枯絲核菌毒素組分包含甘露糖、木糖和半乳糖等6種糖類物質(zhì)。楊迎青等[12]采用GC-MS方法檢測糖類，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid choromatography mass spectrometry，LC-MS)方法檢測苯乙酸及其衍生物，檢測到甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和核糖6種糖類物質(zhì)，未檢出苯乙酸及其衍生物。

植物病原菌毒素對寄主致病范圍不同，可將毒素分為寄主?；远舅?host-specific toxin，HST)和非寄主?；远舅?non-host-specific toxin，NHST)。國內(nèi)外關(guān)于立枯絲核菌毒素屬于HST型或?qū)儆贜HST型的報道均有，但尚未有明確定論。Aoki等[18]主張立枯絲核菌毒素為NHST型毒素，其成分為羧酸及衍生物；Vidhyasekaran等[32]主張立枯絲核菌毒素為HST型毒素，其成分為糖類及糖胺。此外，羧酸及其衍生物毒素中的間羥基苯乙酸、3-甲硫基丙酸和細交鏈孢菌酮酸為毒素的主要毒性成分；糖類及糖胺毒素作為粗毒素混合溶液也具有明顯生物活性，但其中主要毒性成分的確定以及如何共同發(fā)揮作用有待進一步研究。

3 立枯絲核菌毒素的生物活性檢測

生物活性檢測是一種最普遍、最傳統(tǒng)的方法，檢測結(jié)果也最直觀[25]。檢測材料大到整株植物甚至整個群體，小至某個細胞、原生質(zhì)體甚至細胞器或亞細胞器。整株植株檢測材料方法簡單，但要求能大量制備毒素，細胞和原生質(zhì)體檢測材料適合那些不易制備的毒素。立枯絲核菌毒素的生物活性檢測分為粗毒素混合物生物活性檢測和單一化合物生物活性檢測。

3.1 粗毒素混合物生物活性檢測

測定不同菌株的毒素對不同抗性植株毒力強弱的常用方法包括胚根胚芽伸長抑制法、葉鞘針刺接種法和離體葉片針刺法。研究表明，立枯絲核菌毒素對胚根生長有明顯抑制作用，而對胚芽生長抑制作用不明顯。劉洪濤等[35]指出不同菌株毒素毒力差距明顯，致病力強的菌株，毒素毒力越強。Zhou等[36]研究發(fā)現(xiàn)，多核絲核菌分離株產(chǎn)生的毒素毒力最強，對玉米種子發(fā)芽和根的生長抑制率分別高達81.76%和82.99%；雙核絲核菌分離株產(chǎn)生的毒素毒力次之；單核絲核菌分離株產(chǎn)生的毒素毒力最低，對玉米種子發(fā)芽和根的生長抑制率為7.04%和14.93%。Ren等[37]采用一年生苦苣菜、大白菜、菠菜、萵苣、油麥菜和煙草代替水稻對立枯絲核菌毒素的生物活性進行評價，結(jié)果顯示，萵苣是最佳模式植株。張正禹等[14]發(fā)現(xiàn)在不同抗性水平水稻間，同一菌株產(chǎn)生的毒素毒力無明顯差別；但不同水稻組織對毒素的敏感性不同，水稻葉鞘比葉片更為敏感，且通過針刺接種法將毒素接種至葉鞘部位會產(chǎn)生與紋枯病相似的癥狀。

3.2 單一代謝物生物活性檢測

Aoki等[18]在生物活性測定試驗中發(fā)現(xiàn)，當苯乙酸濃度為0.005%時，能抑制油菜和水稻根的生長，苯乙酸濃度達到0.05%時能抑制甜菜根的生長，但隨著濃度的增加不會產(chǎn)生壞死現(xiàn)象；而間羥基苯乙酸為0.025%時能抑制甜菜根的生長，且當濃度達到1%時會產(chǎn)生壞死斑。因此，苯乙酸并不是毒素發(fā)揮毒性的主要成分，立枯絲核菌先產(chǎn)生苯乙酸，再通過各種代謝途徑形成各類衍生物共同發(fā)揮作用。Mandava等[28]通過測定粗毒素和鄰、間、對羥基苯乙酸溶液對萵苣幼苗下胚軸生長、大豆第二節(jié)間伸長和大豆幼苗枯萎及固氮作用的影響來比較其生物活性。結(jié)果顯示，各溶液均對萵苣幼苗下胚軸伸長均有明顯抑制作用；粗毒素和鄰、間羥基苯乙酸溶液均能誘導(dǎo)大豆第二節(jié)間的細胞伸長，而對羥基苯乙酸有明顯抑制作用；較低濃度的粗毒素溶液處理便能使大豆幼苗萎焉，鄰、間、對羥基苯乙酸僅在濃度處理條件下致萎；各溶液均能顯著抑制固氮，且粗毒素與間羥基苯乙酸抑制作用較強。Frederick等[29]研究表明，MTPA處理后的馬鈴薯根長明顯縮短，根的壞死率達80%；75 d后其株高、鮮重和冠層覆蓋率顯著降低，匍匐莖數(shù)量顯著減少且植株患病率高達82%。

4 立枯絲核菌毒素的致病機理

植物病原真菌毒素致病機理十分復(fù)雜[38]。大多研究表明，真菌毒素能干擾和破壞寄主植物的各種代謝，其主要作用位點是細胞質(zhì)膜、葉綠體和線粒體等，同時還對植物蛋白質(zhì)和核酸的合成有一定的抑制作用[39-40]。

4.1 毒素對細胞破壞作用

陳夕軍等[13]和Frederick等[24]對立枯絲核菌粗毒素混合溶液處理后細胞進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)細胞結(jié)構(gòu)破壞明顯：細胞膜解體(圖2-6)直至消失、線粒體(圖2-5)和葉綠體變形、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹(圖2-2)、細胞內(nèi)含物消失(圖2-3)、細胞核內(nèi)可以看見更多的染色質(zhì)、細胞壁松散變薄不再光滑等。這是由于毒素作為一種化學(xué)性的損害因子導(dǎo)致細胞壞死，細胞膜、細胞器、細胞壁和細胞核在結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列的變化。

注：1：對照正常細胞膜結(jié)構(gòu)(×10 000)；2：處理24 h后腫脹質(zhì)粒(×5 000)；3：處理48 h后腫脹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×10 000)；4：處理后72 h細胞內(nèi)含物消失(×20 000)；5：處理馬鈴薯中線粒體的變形(×20 000)；6：處理 馬鈴薯中質(zhì)膜的破裂(×5 000)。Note：1:The normal structure of cell membrane in control (×10 000).2: Plasmids swelling 24 hours after treatment (×5 000). 3:Endoplasmic reticulum swelling 48 hours after treatment (×10 000). 4: Cell inclusions disappeared 72 hours after treatment (×10 000). 5: Deformation of mitochondrial in treatment (×20 000). 6: Rupture of plasma membrane in treatment (×5 000).圖2 立枯絲核菌毒素對馬鈴薯組織和細胞的破壞[24]Fig.2 Destructive effects of Rhizoctonia solani phytotoxin on tissue and cell of potato[24]

4.2 毒素對細胞膜的損傷作用

Vidhyasekaran等[32]和陳夕軍等[13]研究證明，立枯絲核菌毒素處理水稻組織后電解質(zhì)外滲顯著，且處理時間越長，毒素濃度越高，外滲率越高。這是因為毒素作用于類脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物膜從而導(dǎo)致細胞膜透性改變、電解質(zhì)外滲。Ren等[37]研究表明，毒素溶液處理后的水稻和萵苣組織磷素均外滲，但經(jīng)融合群AG1-IA菌株產(chǎn)生的毒素處理后，水稻和萵苣組織細胞磷外滲高達140 μg左右，而經(jīng)融合群AG1-IB菌株產(chǎn)生的毒素處理后，水稻和萵苣組織細胞磷外只有25 μg左右。這說明細胞膜中的類脂可能是毒素的靶標位點，且不同融合群菌株產(chǎn)生的毒素生物活性不同，導(dǎo)致對細胞膜的損傷效果存在顯著。

4.3 毒素對寄主植物酶的影響

雖然開展病原真菌毒素對寄主植物各種酶影響的研究較晚，但進展很快，近年來學(xué)者們研究較多的是β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等病程相關(guān)蛋白[41-43]。此外，毒素對寄主植物體內(nèi)一些防御酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)有一定影響。Sriram等[44]指出立枯絲核菌毒素能誘導(dǎo)水稻植物中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶合成；Ramalingam[45]、徐艷[46]、左示敏等[47]和Paranidharan等[48]研究表明，低濃度和高濃度毒素處理水稻，POD、PPO、PAL、SOD活性變化很小；當毒素稀釋100倍，各酶活性達最大值；且隨著處理時間的延長各酶性活喪失。此外，感病水稻品種比中抗品種各防御酶達到峰值的時間要晚。

5 結(jié)論與展望

立枯絲核菌毒素通常采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌絲生長緊密成團、收集濾液的方法來獲取。立枯絲核菌最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)條件為：pH值7的改良Richard培養(yǎng)液，25～30℃黑暗條件下培養(yǎng)15 d，每隔8 h人工振蕩1次。在毒素純化方面，通常采用萃取蒸發(fā)方法來提取毒素，陳夕軍等[23]研究表明通過乙醚萃取法所得的立枯絲核菌毒素的毒性最強。立枯絲核菌毒素為立枯絲核菌重要致病因子之一。病原菌在培養(yǎng)過程中會向培養(yǎng)液中分泌毒素，不同融合群或亞群病原菌產(chǎn)生的毒素可能不同[49]，且不同的培養(yǎng)液及不同的提取方法獲得的毒素也不同[22、24、33、49]。因此，改善毒素分離和純化方法，獲得能穩(wěn)定制備具有生物活性毒素方法是今后研究的重點之一。

針對立枯絲核菌毒素成分，研究學(xué)者有2種看法：一種認為立枯絲核菌毒素為NHST型，其成分為羧酸及衍生物；另一種認為立枯絲核菌毒素屬HST型，其成分為糖類及糖胺。以上2種看法不統(tǒng)一，尚無明確定論。研究表明，并非代謝物中的所有成分都為毒素物質(zhì)，進一步明確代謝物中發(fā)揮毒性的單一成分并對其分子結(jié)構(gòu)分析是今后研究重點之一。但由于有些成分物質(zhì)分子量相差很小，且不同組分分流時間間隔較小，很難分段收集，因而較難獲得單一組分純品。在毒素生物活性的測定方面，生物活性評價方法有待于進一步規(guī)范統(tǒng)一，毒素發(fā)揮生物活性有待于進行定量分析。

立枯絲核菌毒素致病機理十分復(fù)雜，現(xiàn)有研究還停留在毒素對組織細胞破壞與對寄主植物防御酶影響等基礎(chǔ)方面。近年來Ghosh等[50-51]從立枯絲核菌對水稻葉綠體破壞、光合作用的影響、基因調(diào)控和代謝組的改變來鑒定其侯選致病因子。Sriram等[33]和Shanmugam等[52]發(fā)現(xiàn)分別從黃綠青霉和椰子葉片中分離到的α-葡萄糖苷酶能抑制毒素活性。Vidhyasekaran等[32]早先研究指出，寄主專化性立枯絲核菌毒素成分中有85%為葡萄糖單元，而α-葡萄糖苷酶能水解葡萄糖苷鍵釋放出葡萄糖和其他物質(zhì)[53-54]。因此，α-葡萄糖苷酶可能通過水解葡萄糖苷鍵從而降解毒素。但未對人工合成的α-葡萄糖苷酶進行研究，如果人工合成的α-葡萄糖苷酶具有相同的活性，將具有很好的應(yīng)用前景。此外，Yang等[55]發(fā)現(xiàn)井岡霉素也能減弱立枯絲核菌毒素的毒力。雖然抑制部分真菌產(chǎn)毒基因已被克隆，但在立枯絲核菌上的研究還很少，因此，開展抑制紋枯病菌毒素產(chǎn)生的研究具有十分重要的意義。