盧曾奎 李 青 金美林 費曉娟 魏彩虹,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

長時間的高溫和過熱天氣將對動植物產(chǎn)生嚴重的熱應激。近些年來，熱應激已經(jīng)成為某些地區(qū)最致命的自然災害之一，會降低人們的工作能力和生產(chǎn)效率、動物的生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量以及植物的產(chǎn)量和適應性等[1-3]。

熱應激會影響動物的行為和生產(chǎn)性能，且嚴重熱應激會造成動物組織損傷。動物遭受熱應激后會通過改變行為來促進機體熱量的散失。研究表明，極端高溫天氣時豬會減少活動或橫向躺著以促進熱量散失，還會通過增加打滾次數(shù)和尋找陰涼的地方來減少體溫升高[4-5]。此外，熱應激會給動物重要的生產(chǎn)性狀帶來額外壓力，并降低動物采食量和生長速度，從而導致群體生產(chǎn)力降低。研究表明熱應激不會影響母豬的產(chǎn)仔數(shù)和后代的體重，但是會減少窩仔體重[6]。嚴重熱應激還會造成綿羊肝臟不同程度的損傷，如細胞核發(fā)生移位、核質(zhì)濃縮、細胞中出現(xiàn)空泡和水樣變性等[7]。

血液具有運輸、緩沖和防御等功能，健康動物的血液指標維持在一個相對恒定的范圍內(nèi)。血液生理生化指標的變化可以反映動物的代謝狀況、健康程度和對環(huán)境的適應性等。當動物被病原侵襲或周圍環(huán)境發(fā)生變化(熱應激等)時，其血液成分也隨之變化，在臨床上被作為診斷和治療疾病的重要依據(jù)和參考。本研究通過檢測熱應激和非熱應激湖羊的生理生化指標，試圖尋找一種或多種與湖羊熱應激緊密聯(lián)系的指標，并作為湖羊是否受到熱應激的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在江蘇乾寶牧業(yè)有限公司(中國江蘇省鹽城市)完成，該地區(qū)位于33°28′37.72″N， 120°16′29.65″E，屬于亞熱帶氣候，平均海拔1～4 m，平均氣溫13.7～14.5℃，年降水總量785.2～1 309.5 mm。夏季氣溫高、濕度大，而春季、秋季和冬季氣溫和濕度均比較適中。

1.2 試驗設計

2017年8月(熱應激組)和12月(非熱應激，對照組)分別選擇5月齡純種的健康湖羊36只(公母各半，體重相近)飼養(yǎng)于相同的圈舍中。熱應激組和對照組湖羊飼喂相同的飼料并自由飲水。距離圈舍1.5 m高的地方懸掛5個溫濕度計，每天從8:00—20:00每隔2 h記錄一次溫度(temperature，Td)和相對濕度(relative humidity，RH)。利用溫濕指數(shù)(temperature-humidity index，THI)評價湖羊熱應激程度[8]:

THI=Td-[(0.31-0.31RH)(Td-14.4)]

(1)

當THI<22.2時，無熱應激，當22.2≤THI<23.3時，為中度的熱應激，當23.3≤THI<25.6時，為嚴重的熱應激，當THI≥25.6時，為極度嚴重的熱應激。當THI持續(xù)大于23.3(熱應激組)和持續(xù)小于22.2(對照組)7 d后，分別隨機挑選10只湖羊(公母各半)并在早晨空腹時進行頸靜脈采血。每只湖羊采集2管血液，一管用于血液生理指標分析(EDTA抗凝)，另一管用于血液生化指標分析(不抗凝)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 湖羊生理指標測定 當滿足試驗THI條件時，每天中午12:00隨機選擇6只湖羊(公母各半)，隨后將獸用體溫計(用75%醫(yī)用酒精消毒并涂抹凡士林)由肛門插入湖羊直腸約2/3處，5 min后記錄溫度作為湖羊體溫，連續(xù)記錄7 d。每天中午12:00待湖羊安靜時，隨機選擇6只湖羊(公母各半)測定其呼吸頻率(湖羊胸廓一起一伏記為一次呼吸)，連續(xù)記錄3 min并求其平均值，連續(xù)記錄7 d。每天中午12:00待湖羊安靜時，隨機選擇6只湖羊(公母各半)使用獸用聽診器記錄其第3～第5根肋骨間的心跳數(shù)，連續(xù)記錄3 min，求其平均值作為湖羊的每分鐘心跳次數(shù)，連續(xù)記錄7 d。將抗凝的真空采血管采集的5 mL湖羊血液采用Mindray BC2800三分群血液細胞分析儀(邁瑞，深圳)進行血液生理指標的測定。

1.3.2 湖羊生化指標測定 使用不抗凝的真空采血管采集5 mL湖羊血液，室溫3 000 r·min-1離心15 min后分離血清。使用TOSHIBA Accute 40全自動生化分析儀(東芝，日本)進行血液生化指標的測定。

1.3.3 湖羊血清三碘甲腺原氨酸和甲狀腺素的含量測定 血清中三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，T3)和甲狀腺素(tetraiodothyronime，T4)的含量采用放射免疫的方法進行測定。將T3標準品稀釋成0、20、40、80、160和320 ng·mL-1，共計6個濃度梯度并標記為S0～S5；取測試管若干并編號為NSB(S0)、S0～S5和待測湖羊血清管等；在上述測試管中分別加入50 μL T3標準品或待測湖羊血清；每管加入200 μL 125I-T3標記物；NSB管中加入100 μL去離子水，S0～S5和待測湖羊血清管中加入100 μL羊抗-T3抗體；充分搖勻，37℃溫育45 min；每個試管中加入500 μL T3驢抗羊抗體；充分搖勻，室溫放置15 min后，3 000 r·min-1離心15 min，吸棄上清液；在γ計數(shù)器(賽默飛，美國)上測定各測試管的放射性讀數(shù)，分別記為NSB(空白對照)、B0(S0測試管)和B(S1～S5和待測湖羊血清管)；按照公式計算百分結合率(B/B0)以及標準品和待測樣品的logit值：

(2)

(3)

分別以稀釋后標準濃度梯度和對應logit值為橫縱坐標制作標準曲線；根據(jù)待測湖羊血清的B/B0計算樣品中T3含量。采用同樣的方法測定湖羊血清中T4的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，并使用SPSS 17.0軟件中的Student’s t-test方法進行統(tǒng)計分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 羊舍THI結果

本研究根據(jù)屠宰前一周羊舍的溫度和相對濕度計算THI。對照組期間羊舍THI≤11.82，平均值為9.01，表明湖羊處于無熱應激的狀態(tài)(圖1)。熱應激期間羊舍THI≥26.18，平均值為30.44，表明湖羊處于極度嚴重的熱應激狀態(tài)(圖1)。

圖1 屠宰前一周湖羊舍THIFig.1 The THI of the Hu sheep house 1 week before the slaughter

2.2 湖羊生理指標測定結果

由表1可知，熱應激組湖羊的呼吸頻率顯著高于對照組；熱應激組公羊的平均紅細胞體積和紅細胞壓積極顯著或顯著高于對照組；熱應激組母羊的平均血小板體積顯著高于對照組；其他指標在兩處理組間均無顯著差異。

表1 熱應激對湖羊生理指標的影響Table 1 Influence of heat stress on Hu sheep physiological indexes

2.3 湖羊生化指標測定結果

2.3.1 肝功能指標測定結果 由表2可知，在肝功能指標中熱應激組湖羊的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶濃度均顯著或極顯著高于對照組；其他指標在兩處理組間均無顯著差異。

2.3.2 糖脂代謝指標測定結果 由表3可知，在糖脂代謝指標中熱應激組湖羊的高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著高于對照組；其他指標在兩處理組間均無顯著差異。

2.3.3 腎功能指標測定結果 由表4可知，所測腎功能指標在熱應激組和對照組湖羊之間均無顯著差異。

2.4 湖羊血清中T3和T4含量測定結果

T3和T4具有調(diào)節(jié)機體代謝產(chǎn)熱的功能。圖2為熱應激組和對照組湖羊血清中T3和T4含量，發(fā)現(xiàn)二者在對照組湖羊中均極顯著高表達。

3 討論

本研究根據(jù)Marai等[8]的方法計算了宰前一周羊舍的THI。對照組羊舍THI≤11.82，湖羊處于無熱應激的狀態(tài)；而熱應激組羊舍THI≥26.18，湖羊處于極度嚴重的熱應激狀態(tài)。因此，本研究中熱應激組和對照組湖羊所處的環(huán)境滿足試驗需求。

當動物遭受熱應激時，需要尋找一種熱舒適性方式來減少體內(nèi)熱量的增加。該過程幾乎涉及動物所有系統(tǒng)的相互協(xié)調(diào)才能完成。但是動物的耐熱性受品種和地域影響的差異性較大。因此，有關特定品種的耐熱信息是必須的。一般動物對熱應激的反應可以通過一些生理指標和血液生化指標進行衡量。

表2 熱應激對湖羊肝功能指標的影響Table 2 Influence of heat stress on Hu sheep liver function indexes

表3 熱應激對湖羊糖脂代謝指標的影響Table 3 Influence of heat stress on Hu sheep glycolipid metabolism indexes

研究表明動物的直腸溫度和呼吸頻率被認為是熱應激評價的良好指標，可用于評估熱應激[9-10]。本研究結果表明，熱應激組湖羊的直腸溫度較對照組有增加趨勢但差異不顯著。湖羊和其他哺乳動物一樣，體溫的穩(wěn)態(tài)通常在出生時或第一年的成長過程中已被逐漸確定，因此熱應激不會造成湖羊體溫發(fā)生較大變化。熱應激后湖羊體溫稍有增加可能是由熱應激條件下動物的代謝熱量增加導致的。呼吸途徑被認為是綿羊散熱的最有效方式[11]。熱應激組湖羊的呼吸頻率顯著高于對照組，表明熱應激組湖羊急需激活體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)來消除過多熱量以維持較低體溫。本研究中熱應激組湖羊的心跳頻率也較對照組高，但二者差異不顯著，這與小尾寒羊中觀察到的結果相似[12]。其心跳頻率的增加可能是由熱應激期間血液重新分布到外周組織造成的[13]。

表4 熱應激對湖羊腎功能指標的影響Table 4 Influence of heat stress on Hu sheep kidney function indexes

注：** 表示處理間差異極顯著(P < 0.01)。Note: ** indicate significant difference between treatments at 0.01 level.圖2 熱應激對湖羊血清中T3和T4含量的影響Fig.2 Influence of heat stress on serum T3 and T4 contents of Hu sheep

有研究表明熱應激可以增加綿羊血液中紅細胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，這與熱應激期間動物加快呼吸頻率迫使紅細胞數(shù)量和血紅蛋白濃度增加以滿足機體耗氧量的需求有關[14-15]。但本研究發(fā)現(xiàn)熱應激組和對照組湖羊的紅細胞計數(shù)和血紅蛋白濃度均無顯著差異。這可能是由于與放牧羊群相比，本研究中羊舍里裝有自動飲水裝置，湖羊可以隨時飲水。即使在熱應激期間湖羊體內(nèi)也不會缺水，進而不會引起血液濃縮。此外，也可能與湖羊自身的適應性有關。白細胞數(shù)量的變化可以反映機體的防御能力。本研究發(fā)現(xiàn)熱應激組湖羊血液中白細胞數(shù)量遠低于對照組，表明熱應激造成湖羊防御能力降低，這與其他動物中的研究結果相同[16]。

肝臟是機體內(nèi)代謝最旺盛的組織器官之一，肝功能指標可以反映肝臟代謝、排泄和免疫等功能以及肝實質(zhì)的損傷程度。與對照組湖羊相比，熱應激組湖羊血清中總蛋白濃度有所降低但差異不顯著。這可能是因為熱應激期間湖羊采食量下降，造成蛋白質(zhì)攝入量下降進而影響總蛋白含量[17]。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是反映肝實質(zhì)損傷的關鍵指標，當肝細胞發(fā)生損傷時前者在血清中的濃度可以增加一倍，后者的濃度持續(xù)升高表明損傷程度加重[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應激組湖羊血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度有增加的趨勢(0.27～0.89倍)，而天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度顯著增加(3.79～5.08倍)，表明熱應激可能造成了湖羊肝臟組織損傷。

血液中葡萄糖濃度受營養(yǎng)條件和生理條件的影響，如能量攝入、能量需求、體脂肪儲備和動員等均會引起血液中葡萄糖濃度的變化[20-21]。當動物遭受熱應激時，體溫和呼吸頻率均高于正常水平，湖羊的能量需求也會大量增加進而導致血液中葡萄糖濃度降低。此外，熱應激期間湖羊采食量下降，也可能導致血液中葡萄糖濃度降低。有研究表明，熱應激也會降低動物血液中膽固醇和甘油三酯的濃度[22-23]，可能是因為血液中葡萄糖濃度降低促進了脂解作用，進而引起膽固醇和甘油三酯的濃度降低。但也有研究表明，熱應激不會引起綿羊血液中葡萄糖和膽固醇濃度的變化[24]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)熱應激沒有改變湖羊血液中總膽固醇和甘油三酯的濃度，這可能與遺傳(品種、年齡和生理狀態(tài)等)和環(huán)境因素(溫度、飼料和飲水等)有關。

較多研究表明，熱應激會使血液中尿素氮、尿素和肌酐的濃度增加，這是由于熱應激減少了腎臟的血流分布，使更多血液流向外周從而帶走體內(nèi)更多的熱量[12, 25-26]。但本研究發(fā)現(xiàn)，熱應激未改變血液中尿素氮、尿素和肌酐的濃度，表明熱應激未使湖羊腎功能受到實質(zhì)損傷，也未引起湖羊脫水。在泌乳母羊熱應激的研究中發(fā)現(xiàn)，熱應激對血液中尿素氮濃度的影響非常小或無影響[27]。但也有研究發(fā)現(xiàn)熱應激會使Omani羊血液中尿素氮含量增加，而使Merino羊血液中尿素氮含量降低，表明血液中尿素氮濃度可能在不同綿羊品種之間具有一定的差異性[21]。

三碘甲腺原氨酸和甲狀腺素是由甲狀腺及其外周組織所分泌的激素。三碘甲腺原氨酸是一種對合成代謝和分解代謝均起作用的甲狀腺激素，其分泌量減少被認為是動物努力減少體熱產(chǎn)生和積累，并保持機體熱量平衡[11, 28]。甲狀腺素在動物適應環(huán)境變化的過程中也具有重要作用，它可以刺激細胞內(nèi)氧氣消耗和熱量產(chǎn)生，從而提高基礎代謝率，增加葡萄糖利用率并改變脂質(zhì)代謝[28-29]。本研究結果表明，熱應激組湖羊血液中三碘甲腺原氨酸和甲狀腺素的濃度均顯著低于對照組，該結果與其他綿羊品種的研究結果一致[26]。表明熱應激可使湖羊的代謝活動降低以抑制機體產(chǎn)生更多的熱量。此外，甲狀腺素濃度的降低也可能與血液中葡萄糖濃度降低有關，甲狀腺素濃度與熱應激期間的能量代謝密切相關。

4 結論

本研究通過比較分析了熱應激組和對照組湖羊的生理生化指標，發(fā)現(xiàn)呼吸頻率、平均紅細胞體積、紅細胞壓積、平均血小板體積、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶和高密度脂蛋白膽固醇等指標在兩處理之間存在顯著或極顯著差異。此外，三碘甲腺原氨酸和甲狀腺素含量在熱應激組和對照組湖羊之間也存在極顯著差異，以上指標均可以作為評估湖羊熱應激的依據(jù)。