周小華 周澤儀 李昆志

(1 昆明學(xué)院昆明滇池(湖泊)污染防治合作研究中心，云南 昆明 650214；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510000；3 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

酸性土壤占全球可耕面積的50%[1]，其中我國酸性土壤占全國可耕面積的21%[2]。當(dāng)土壤pH值低于5.5時(shí)，土壤中難溶性鋁可溶解釋放出Al3+，微摩爾級(jí)Al3+即可對(duì)植物造成毒害，嚴(yán)重抑制根系的生長(zhǎng)以及氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3]，導(dǎo)致水稻[4]、大豆[5]等作物減產(chǎn)。我國約有30%的水稻生長(zhǎng)在酸性土壤中，鋁毒已成為水稻生長(zhǎng)及產(chǎn)量的重要限制因素之一。

抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)是植物體內(nèi)重要的非酶抗氧化物質(zhì)，可維持植物逆境條件的氧化還原平衡及物質(zhì)代謝，促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)[6-7]。已有研究表明，外源AsA可改善鹽脅迫下商麥1619種子的抗氧化酶活性和發(fā)芽率[8]，提高鉛脅迫下秋葵的抗氧化能力[9]，降低鉻脅迫下小麥的活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，有效減輕根系細(xì)胞受鉻的毒害程度[10]，提高鹽脅迫下大麥的脯氨基含量[11]，提高Na2SO4脅迫下燕麥幼苗活力指數(shù)和根長(zhǎng)[12]，改善逆境條件下植物的生長(zhǎng)狀態(tài)。然而，外源AsA對(duì)鋁脅迫下水稻抗氧化能力的影響尚不清楚，本研究以四葉齡水稻幼苗為試驗(yàn)材料，探討鋁脅迫下添加外源AsA對(duì)根尖過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響，研究外源AsA在水稻抵御逆境脅迫過程中的作用及生理生化影響機(jī)制，以期為外源AsA在緩解水稻鋁毒方面的應(yīng)用提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻(OryzasativaL.)品種為滇優(yōu)5號(hào)，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的水稻幼根，用pH值4.5的0.05 mmol·L-1CaCl2溶液預(yù)處理12 h后，再轉(zhuǎn)移至鋁離子濃度為0(CK)、20、50、100、200、400 μmol·L-1的AlCl3營(yíng)養(yǎng)液(內(nèi)含CaCl2，pH值4.5)處理3～24 h。每組10個(gè)重復(fù)，用于測(cè)量相對(duì)根伸長(zhǎng)量及進(jìn)行染色試驗(yàn)。

將發(fā)芽的種子用pH值4.5，1/4濃度的水稻營(yíng)養(yǎng)液(IRRI，國際水稻所)培養(yǎng)至一葉齡幼苗，然后用pH值4.5的水稻全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)[13]，每2 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，于25℃、光照(1 200 μmol·m-2·s-1)12 h·d-1的溫室中，置于盛有3.5 L營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。水稻長(zhǎng)至四葉齡時(shí)，在AsA濃度分別為0、0.5、1、2、4、8 mmol·L-1，pH值4.5的水稻全營(yíng)養(yǎng)液中添加50 μmol·L-1AlCl3處理24 h，分析根尖H2O2含量，以確定AsA最佳處理濃度。以無鋁無AsA處理為對(duì)照(CK)，在鋁濃度分別為0、50、100、200、400 μmol·L-1水稻全營(yíng)養(yǎng)液中，添加AsA最佳濃度處理水稻24 h，每組3個(gè)重復(fù)。收集根尖(0～20 mm)，用于測(cè)定H2O2含量、MDA含量、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、根系活力、內(nèi)源AsA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 相對(duì)根伸長(zhǎng)率 直尺測(cè)量不同鋁濃度處理3、6、12、18、24 h時(shí)前后幼根的長(zhǎng)度，前后2次測(cè)量值的差值即為幼苗根的伸長(zhǎng)量，相對(duì)根伸長(zhǎng)率=鋁脅迫處理不同時(shí)間根的凈伸長(zhǎng)量/CK根凈伸長(zhǎng)量×100%。

1.3.2 鉻天青染色 分別取不同鋁濃度溶液(pH值4.5)處理24 h的水稻幼根，去離子水浸洗2～3次，去除表面的殘留鋁，然后置于0.1%鉻天青染色液染色15 min，浸洗至溶液為無色，顯微鏡觀察根尖的染色情況。

1.3.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 參照Gay等[14]的方法測(cè)定H2O2含量；參照Chen等[15]的方法測(cè)定MDA含量；參照陳建勛等[16]的方法測(cè)定POD、SOD、APX、CAT活性，根系活力以及脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量；參照李媚等[17]的方法測(cè)定內(nèi)源AsA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007處理數(shù)據(jù)并作圖，使用SPSS 21.0軟件采用Duncan，s法分析數(shù)據(jù)差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻耐鋁性分析

由圖1-A可知，水稻的相對(duì)根伸長(zhǎng)率隨著鋁脅迫濃度增加及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，50～400 μmol·L-1鋁脅迫處理組的相對(duì)根伸長(zhǎng)率為CK的0.80～0.48倍，相對(duì)根伸長(zhǎng)率基本與鋁脅迫24 h的根生長(zhǎng)表型一致(圖1-B)。由圖2-A可知，根尖鋁含量隨著鋁脅迫濃度增加而增加，根尖鉻天青特異性染色深度(圖2-B)與根尖鋁含量呈正相關(guān)關(guān)系，濃度≤50 μmol·L-1鋁脅迫處理組水稻的根尖區(qū)域染色相對(duì)較淺，而濃度>50 μmol·L-1鋁脅迫處理組水稻的根尖顏色隨著濃度增加逐漸加深，并出現(xiàn)損傷性裂紋，說明根的完整性受到破壞。

2.2 不同外源AsA濃度對(duì)鋁脅迫水稻根尖H2O2含量的影響

由圖3可知，與單一鋁脅迫組相比，AsA處理組根尖H2O2含量均有不同程度的降低，外源AsA濃度≥1 mmol·L-1時(shí)，根尖H2O2含量均顯著低于單一鋁脅迫組，其中2、4、8 mmol·L-1AsA處理組根尖的H2O2含量均顯著低于1 mmol·L-1AsA處理組，但三組之間的H2O2含量無顯著差異。表明2 mmol·L-1的外源AsA能有效地降低根尖H2O2含量，因此，采用2 mmol·L-1的外源AsA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根系活力的影響

由圖4可知，水稻根系活力隨鋁脅迫濃度增加而減小，50 μmol·L-1鋁脅迫處理組的根系活力是CK的0.79倍，外源AsA+50 μmol·L-1鋁脅迫處理組的根系活力則恢復(fù)到CK的0.93倍，且與CK無顯著差異，是單一鋁脅迫處理組根系活力的1.18倍；400 μmol·L-1鋁脅迫處理組的根系活力僅為CK的0.40倍，外源AsA+400 μmol·L-1鋁脅迫處理組的根系活力則恢復(fù)到CK的0.45倍，是單一鋁脅迫處理組根系活力的1.12倍。表明外源AsA可以顯著提高水稻根系活力。

2.4 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖H2O2及MDA含量的影響

鋁脅迫下水稻根尖H2O2和MDA含量與鋁濃度呈正相關(guān)關(guān)系，50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的H2O2(圖5-A)和MDA(圖5-B)含量分別為CK的1.55和1.86倍，外源AsA+50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的H2O2和MDA含量降低至CK的1.15和1.51倍，是單一鋁脅迫處理組的0.74和0.81倍；400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的H2O2和MDA含量分別為CK的2.53和4.16倍，外源AsA+400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的H2O2和MDA含量降低至CK的2.04和3.69倍，是單一鋁脅迫處理組的0.81和0.89倍。表明鋁脅迫增加了根尖H2O2和MDA含量，外源AsA可有效降低根尖H2O2的積累和膜脂過氧化程度。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 鋁脅迫處理水稻的相對(duì)根伸長(zhǎng)率(A)及根系生長(zhǎng)表型(B)Fig.1 Relative root enlongth(A) and phenotype(B) of rice roots under Al3+stress

圖2 鋁脅迫處理水稻根尖鋁含量(A)及鉻天青染色(B)Fig.2 The Al3+ content(A) and chromazurol staining(B) of rice root tips under Al3+ stress

圖3 外源AsA濃度對(duì)鋁脅迫水稻根尖H2O2含量的影響Fig.3 Effects of exogenous AsA concentration on the content of H2O2 in rice root tips under Al3+ stress

圖4 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根系活力的影響Fig.4 Effects of exogenous AsA on root activity in rice under Al3+ stress

圖5 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖H2O2(A) 與MDA(B)含量的影響Fig.5 Effects of exogenous AsA on H2O2 (A)and MDA (B)content in rice root tips under Al3+ stress

圖6 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖可溶性蛋白質(zhì)(A)、可溶性糖(B)及游離脯氨酸含量(C)的影響Fig.6 Effects of exogenous AsA on the contents of the souble protein(A), soluble sugar(B) and free proline(C)in rice root tips under Al3+ stress

2.5 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量的影響

隨著鋁脅迫濃度增加，水稻根尖可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低(圖6-A)，可溶性糖和游離脯氨酸含量(圖6-B、C)顯著增加。50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量分別為CK的0.65、1.61和1.65倍；外源AsA+50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量分別為CK的0.75、1.87和2.29倍，是單一鋁脅迫處理組的1.15、1.16和1.39倍；400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量分別為CK的0.32、2.02和2.73倍；外源AsA+400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量分別為CK的0.37、2.12和2.96倍，是單一鋁脅迫處理組的1.16、1.05和1.09倍。表明外源AsA可提高鋁脅迫下根尖可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸等滲透物質(zhì)的含量，有利于維持鋁脅迫下的質(zhì)膜滲透平衡。

2.6 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖SOD、POD、CAT和APX活性的影響

由圖7可知，50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的SOD、POD、CAT和APX活性分別是CK的1.77、1.81、1.76和1.73倍，外源AsA+50 μmol·L-1鋁脅迫處理組的SOD、POD、CAT和APX活性分別提高至CK的2.24、2.20、2.28和2.13倍，是單一鋁脅迫處理組的1.26、1.22、1.30和1.13倍；400 μmol·L-1鋁脅迫處理組的SOD、POD、CAT和APX活性分別是CK的2.39、2.42、2.76和2.56倍，外源AsA+400 μmol·L-1鋁脅迫處理組的SOD、POD、CAT和APX活性分別提高至CK的2.48、2.63、2.90和2.89倍，是單一鋁脅迫處理組的1.04、1.09、1.05和1.13倍。鋁脅迫能提高根尖抗氧化酶的活性，外源AsA能加強(qiáng)這種提升效果，清除更多的ROS，表明外源AsA可以提高根尖抗氧化酶的活性，以增強(qiáng)植株清除ROS的能力。

圖7 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖SOD(A)、POD(B)、CAT(C)及APX(D)活性的影響Fig.7 Effects of exogenous AsA on the activities of SOD(A), POD(B), CAT(C) and APX(D) in rice root tips under Al3+ stress

圖8 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖內(nèi)源AsA含量的影響Fig.8 Effects of exogenous AsA on content of endogenous AsA in rice root tips under Al3+ stress

2.7 外源AsA對(duì)鋁脅迫水稻根尖內(nèi)源AsA含量的影響

AsA是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，植物抵抗非生物脅迫的能力與AsA含量呈正相關(guān)關(guān)系[18]。由圖8可知，根尖內(nèi)源AsA含量隨著鋁脅迫濃度增加而降低，50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的內(nèi)源AsA含量為CK的0.93倍，外源AsA+50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的內(nèi)源AsA含量為CK的1.32倍，為單一鋁脅迫處理組的1.42倍；400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的內(nèi)源AsA含量為CK的0.47倍，外源AsA+400 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖的內(nèi)源AsA含量為CK的0.54倍，為單一鋁脅迫處理組的1.14倍。說明鋁脅迫降低了水稻根尖的內(nèi)源AsA含量，而外源AsA提高了水稻根尖的內(nèi)源AsA含量。

3 討論

植物根尖是受鋁脅迫作用的最初部位，鋁能夠與作物根尖細(xì)胞結(jié)合，影響根尖細(xì)胞的分裂與伸長(zhǎng)，導(dǎo)致根尖變短變粗，常用相對(duì)根伸長(zhǎng)率及鉻天青特異性染色來判斷植物耐鋁能力。本研究表明，水稻的相對(duì)根伸長(zhǎng)率隨著鋁濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)均降低，鉻天青染色深度與根尖鋁含量呈正相關(guān)關(guān)系，濃度≤50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖鉻天青染色相對(duì)較淺，水稻根的生長(zhǎng)雖然受到一定程度的抑制，但仍能維持生長(zhǎng)；而濃度>50 μmol·L-1鋁脅迫處理組根尖鋁含量逐漸增加，鉻天青染色加深，根形態(tài)變粗且有裂紋，相對(duì)根伸長(zhǎng)率逐漸降低，表明鋁脅迫已經(jīng)逐漸破壞水稻根系結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重抑制了根的生長(zhǎng)。水稻根尖累積了一定量的鋁后，會(huì)產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致根系活力下降，抑制水稻根的生長(zhǎng)，這與黃玉婷等[19]關(guān)于鋁脅迫抑制根生長(zhǎng)的研究結(jié)果相似。

H2O2是植物氧化損傷的主要指標(biāo)，MDA是質(zhì)膜過氧化的產(chǎn)物，H2O2、MDA含量可以反映質(zhì)膜過氧化水平及植物抗逆能力[20]。已有研究表明，鋁脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物根尖質(zhì)膜過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致植物大量積累H2O2等ROS[21-23]。本研究表明，鋁脅迫導(dǎo)致根尖H2O2和MDA含量顯著上升，水稻根系的氧化損傷程度隨鋁濃度增加而加劇，致使根系積累較多的H2O2。這與鋁脅迫下玉米、水稻中H2O2和MDA含量的變化趨勢(shì)相似[24-25]，也反映出微摩爾級(jí)的鋁即可對(duì)植物造成傷害[26]。此外，施用外源AsA能在一定程度上降低H2O2和MDA含量，這與Ashraf等[27]研究外源AsA降低鹽脅迫下小麥體內(nèi)ROS的結(jié)果一致，表明外源AsA可以提高清除ROS的能力，緩解鋁脅迫對(duì)水稻質(zhì)膜的過氧化傷害，有效地維持幼苗正常的生理生化反應(yīng)，提高水稻的耐鋁能力。

可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量與細(xì)胞的滲透平衡和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性具有一定的相關(guān)性，植物積累的可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸越多，表示其抗逆能力越強(qiáng)[28]。本研究表明，根尖可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鋁脅迫濃度增加而降低，脯氨酸含量隨著鋁脅迫濃度增加而增加，可能是由于鋁脅迫加劇了根尖細(xì)胞質(zhì)膜過氧化程度，使蛋白質(zhì)分解加快，合成受阻，含量降低，通過增加脯氨酸含量來維持質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整及滲透平衡，這與韓德鵬等[29]研究鋁脅迫降低了油菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，提高了脯氨酸含量的結(jié)果相似；施用外源AsA可提高可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量，可能是外源AsA促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水合作用，進(jìn)而提高了可溶性蛋白質(zhì)含量，提高脯氨酸含量可能有助于調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞氧化還原勢(shì)和滲透壓，從而減少質(zhì)膜的損傷。表明外源AsA能夠提高水稻體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，維持細(xì)胞質(zhì)膜的滲透平衡與結(jié)構(gòu)完整，從而提高對(duì)質(zhì)膜的保護(hù)作用，降低鋁脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的不利影響。

在環(huán)境脅迫下，植株為了抵御自由基引發(fā)的氧化脅迫，會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，通過提高SOD、POD、APX及CAT活性清除ROS，從而減輕逆境脅迫對(duì)植物的傷害程度[30]。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫可提高水稻的抗氧化酶活性，表明鋁脅迫在誘導(dǎo)氧化脅迫的同時(shí)，也誘導(dǎo)了抗氧化酶基因的表達(dá)，使抗氧化酶活性增加，清除更多的ROS，以緩解鋁誘導(dǎo)的氧化損傷，這與吳雪霞等[31]報(bào)道的鋁脅迫下柑橘中抗氧化酶活性增加的研究結(jié)果一致；施用外源AsA使鋁脅迫水稻根尖SOD、POD、APX及CAT活性進(jìn)一步增強(qiáng)，可能是AsA通過上調(diào)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)提高了抗氧化酶活性[32]，該研究結(jié)果與Dolatabadian等[33]發(fā)現(xiàn)外源AsA提高干旱脅迫玉米的抗氧化酶活性的結(jié)果相似。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致水稻內(nèi)源AsA含量減少，說明AsA可能直接參與清除鋁脅迫誘導(dǎo)的ROS或鋁脅迫可能抑制水稻內(nèi)源AsA的生物合成，這與Sharma等[34]關(guān)于鋁脅迫降低水稻AsA含量的研究結(jié)果一致；而施用外源AsA可提高鋁脅迫水稻的內(nèi)源AsA含量，可能是外源AsA促進(jìn)了內(nèi)源AsA的生物合成和循環(huán)再生[35]，這與Wang等[36]研究的外源AsA可提高水稻根系A(chǔ)sA含量的結(jié)論一致。可見外源AsA通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和AsA含量來調(diào)控水稻鋁脅迫的應(yīng)答機(jī)制。但外源AsA對(duì)鋁脅迫的緩解作用是通過調(diào)控相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)起主要作用，還是直接上調(diào)內(nèi)源AsA的合成以平衡鋁誘導(dǎo)的ROS占主導(dǎo)地位，還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，鋁脅迫誘導(dǎo)水稻幼苗產(chǎn)生氧化損傷，且氧化損傷程度與鋁濃度呈正相關(guān)關(guān)系，外源AsA通過上調(diào)鋁脅迫水稻根尖抗氧化酶活性及內(nèi)源AsA含量，增強(qiáng)ROS的清除能力，顯著降低了膜脂過氧化產(chǎn)物的含量，并提高了可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，使其保持在較穩(wěn)定的高水平狀態(tài)，維持穩(wěn)定的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及滲透平衡，可有效緩解鋁脅迫對(duì)幼苗質(zhì)膜的毒害作用，增強(qiáng)水稻的抗氧化能力。本研究結(jié)果為外源AsA在改善酸鋁條件下水稻生長(zhǎng)方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。