孫 葉 劉 紅 李風(fēng)童 劉春貴 周春華 包建忠 陳秀蘭 趙國琦,*

(1 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225007)

春蘭(Cymbidiumgoeringii)是蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)的原生種之一，大花蕙蘭(C.hybridum)是蘭屬的雜交種。蘭屬植物約有48個(gè)原生種，目前已知用來作為大花蕙蘭雜交親本的原生種有近20種，其中也包括春蘭。春蘭是傳統(tǒng)國蘭的重要代表種之一，自然花期正值我國傳統(tǒng)節(jié)日春節(jié)前后，在年銷花市場(chǎng)有很大的開發(fā)潛力。受傳統(tǒng)蘭文化的影響，春蘭優(yōu)良品種以瓣型綠花為主，紅花品種稀缺。大花蕙蘭是當(dāng)今全球暢銷的主要蘭花種類之一，作為我國年銷花市場(chǎng)高檔盆栽花卉的明星品種，年銷售量在200萬盆以上[1]。大花蕙蘭品種的花形、花色極為豐富，在花色素、花色基因及轉(zhuǎn)基因調(diào)控花色等研究方面也取得了很大的進(jìn)展[2-3]，但大多數(shù)品種無香味、葉形散亂，在我國達(dá)不到春化溫度的南方地區(qū)不易種植開花[4]。目前利用春蘭優(yōu)良品種與大花蕙蘭遠(yuǎn)緣雜交選育小花型、花色豐富、有香味、耐寒的蘭屬新品種是市場(chǎng)開發(fā)的熱點(diǎn)[5]，同時(shí)這些新品種也是研究花色形成和呈色機(jī)理的理想材料。

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)彌補(bǔ)了非模式生物缺乏參考基因組信息的不足，已在觀賞植物領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭、春劍等國蘭利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在花發(fā)育、花色、葉色、葉形等相關(guān)功能基因的挖掘和基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析方面取得了很大的進(jìn)展[6-12]。蘭科植物的花色主要由類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素的含量及其比例決定，花青苷是紅花顯色最重要的色素。植物中類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素合成代謝途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因已研究得比較清晰，影響結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子正成為研究熱點(diǎn)，其中MYB(V-myb avain myeloblastosis viral ohcogene)轉(zhuǎn)錄因子的研究最為廣泛[13-15]。目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了339個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，位于美國斯坦福大學(xué)的擬南芥信息資源網(wǎng)站(TheArabidopsisInformation Resource, TAIR)已公布了133個(gè)MYB成員。MYB轉(zhuǎn)錄因子中 R2R3-MYB 的數(shù)量最多，在擬南芥和水稻已分別鑒定出126和109個(gè)R2R3-MYB家族成員[16]。根據(jù)蛋白C端保守的氨基酸基序的分析，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子劃分為 28 個(gè)不同的亞家族[17]，其中S7、S6 和 S2亞家族分別對(duì)黃酮醇[18]、花青素及原花青素[19]的調(diào)控起關(guān)鍵作用。植物花青苷的合成代謝途徑中MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合體調(diào)控模式處于核心地位[20]，其中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子起關(guān)鍵性作用[21]，Hsu等[22]認(rèn)為PeMYB2、PeMYB11和PeMYB12三個(gè) R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子以不同比例的組合表達(dá)導(dǎo)致蝴蝶蘭中大量復(fù)雜的花色素沉著模式。

蘭科植物調(diào)控花色的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的研究已取得了很大的進(jìn)展[23]，但相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證主要集中在洋蘭上，關(guān)于國蘭的研究進(jìn)展緩慢，春蘭花色形成的分子機(jī)理更鮮見報(bào)道。前期研究[24]發(fā)現(xiàn)綠花春蘭品種間雜交，F(xiàn)1出現(xiàn)了紅花新種質(zhì)；綠花春蘭品種與黃花大花蕙蘭品種雜交，F(xiàn)1同樣也出現(xiàn)了紅花新種質(zhì)，且花器官不同發(fā)育階段顯色差異較大。本研究采用綠花春蘭品種與黃花大花蕙蘭品種的紅花雜交后代黃金梅2個(gè)不同發(fā)育期的花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，解析測(cè)序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)挖掘春蘭與大花蕙蘭種間雜交種花色相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子，探究基因的表達(dá)調(diào)控及不同發(fā)育期花瓣色素含量的變化，旨在為花色基因的克隆及功能分析，花色調(diào)控及呈色機(jī)理的解析和新種質(zhì)的定向選育提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

供試材料黃金梅是母本綠花春蘭大宋梅(圖1-A)與父本黃花大花蕙蘭黃金虎(圖1-B)的雜交種，保存于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中國蘭種質(zhì)資源圃。該種質(zhì)花器官遺傳了母本的瓣型和父本的著花數(shù)特征，花色發(fā)生了變異，小花蕾期為淡黃綠色，隨著花蕾的發(fā)育逐漸轉(zhuǎn)色，綻蕾后花色漸變?yōu)樽霞t色，與父、母有明顯差異。2019年1月選取黃金梅同一株系不同發(fā)育期小花蕾樣品(圖1-C)、黃綠色小花蕾花瓣(主瓣和側(cè)瓣)(圖1-D)、紫紅色始花期小花瓣(主瓣和側(cè)瓣)(圖1-E)，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，剩余花瓣同時(shí)采樣用于花色素測(cè)定。取樣前用無水乙醇輕擦拭外瓣，分別設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即用液氮凍存，測(cè)序材料用干冰保存送至上海為青生物技術(shù)有限公司進(jìn)行RNA提取，構(gòu)建cDNA文庫，在Illumina HiseqTM 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序；得到原始測(cè)序序列(sequenced reads)，即原始數(shù)據(jù)(raw data)。通過過濾去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%、低質(zhì)量序列、帶接頭(adapter)的reads，最終獲得Clean Data后，利用Trinity軟件對(duì)Clean Data進(jìn)行序列組裝，得到Unigene庫。

注：A:母本大宋梅；B:父本黃金虎；C:雜交種黃金梅；D:小花蕾期；E：始花期。Note: A:Female parent Dasongmei. B:Male parent Huangjinhu.C:Hybrid Huangjinmei. D:Little flower Bud stage. E:Opening stage.圖1 取樣材料及其親本Fig.1 Sampling materials and their parents

1.2 差異表達(dá)基因功能注釋、富集分析及花色素基因分析

使用BLAST軟件將測(cè)序Unigene與Pfam、TrEMBL、eggNOG、Swiss-Prot、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息，對(duì)差異表達(dá)基因(differential express genes, DEGs)做GO功能富集分析、KEGG注釋及通路富集分析。檢索類黃酮、類胡蘿卜素及葉綠色合成途徑中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因及花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子信息，獲取相關(guān)基因的核苷酸長度及2樣本差異表達(dá)的FPKM(fragments per kilobase per million)值。利用BLAST軟件在NCBI數(shù))據(jù)庫中篩選花青苷合成途徑中下游關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子的同源基因。

1.3 基因轉(zhuǎn)錄模式驗(yàn)證

選擇類黃酮及類胡蘿卜素形成關(guān)鍵通路14個(gè)表達(dá)差異較大基因設(shè)計(jì)引物(表1)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)提取的小花蕾、始花期花瓣RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR) 反應(yīng)的模板，在LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)中進(jìn)行，驗(yàn)證基因的表達(dá)。根據(jù)SYBR?PremixExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa公司)說明書配置反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系：SYBRPremixExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus) (2×) 10.0 μL、10 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL、cDNA模板50～100 ng、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火，延伸20 s， 40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析程序：95℃持續(xù)1 s，65℃持續(xù)60 s，97℃持續(xù)1 s。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 基因及內(nèi)參引物信息Table 1 The primer information of gene and internal reference

1.4 總花青素苷、總黃酮、類胡蘿卜素及葉綠素含量測(cè)定

花青素及黃酮提取參考Yang等[25]的方法，總花青素苷含量(total anthocyanin content, TAC)測(cè)定采用可見分光光度法[26]，總黃酮含量(total flavonoids content, TFC)的測(cè)定采用AlCl3顯色法[27],重復(fù)3次。參照 Lichtenthaler 等[28]的方法進(jìn)行葉綠素和類胡蘿卜素含量的測(cè)定，3次重復(fù)。采用SPSS 17.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)計(jì)算不同發(fā)育期色素含量的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析與組裝

提取試驗(yàn)材料黃金梅小花蕾期和始花期花瓣的總RNA，結(jié)果顯示，A樣品RNA濃度為276 μg·μL-1，總量為27.6 μg；B樣品RNA濃度為291 μg·μL-1，總量為29.1 μg；OD260/280>2.0，OD260/230>1.8，RIN>9.0，28S:18S>1.6；凝膠電泳結(jié)果顯示5S、18S、28S條帶完整，樣品質(zhì)量符合建庫標(biāo)準(zhǔn)要求。建庫后對(duì)2個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)FASTX過濾后共獲得高質(zhì)量堿基序列140 453 340個(gè)，堿基數(shù)為39 908 521 302 bp， 2個(gè)樣品Mapped Reads在Clean Reads中所占比例分別為86.83%(A)、88.29%(B)；質(zhì)量值Q20和Q30均大于90%，GC含量均大于47.5%，證明測(cè)序質(zhì)量好。Trinity合并組裝后分析統(tǒng)計(jì)拼接長度數(shù)據(jù)(表2)，得到 188 837條Transcript和113 780條Unigene，其中200～300 bp的Unigene比例最高有48 564 條，比例最少的為1 500～2 000 bp的Unigene 4 041條，僅占3.55%；組裝得到Transcript與Unigene的平均長度為725.64 bp和586.53 bp，N50分別為1 229 bp 和882 bp，組裝完整性較高，可進(jìn)行下一步分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組長度分布統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of the length distribution of the transcriptome

注：1：胞外區(qū)；2：細(xì)胞；3：細(xì)胞核；4：細(xì)胞膜；5：細(xì)胞連接；6：胞外基質(zhì)；7：膜封閉腔；8：復(fù)雜大分子；9：細(xì)胞器；10：細(xì)胞外基質(zhì)部分；11：細(xì)胞外區(qū)域部分；12：細(xì)胞器組分；13：病毒粒子部分；14：膜結(jié)構(gòu)；15：細(xì)胞組分；16：蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；17：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；18：催化活性；19：受體活性；20：鳥嘌呤核苷酸交換因子活性；21：結(jié)構(gòu)分子活性；22：轉(zhuǎn)運(yùn)活性；23：結(jié)合；24：電子載體活性；25：抗氧化活性；26：金屬伴隨子活性；27：酶調(diào)節(jié)活性；28：營養(yǎng)貯存活性；29：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；30：繁殖；31：細(xì)胞殺傷；32：免疫系統(tǒng)過程；33：代謝過程；34：細(xì)胞過程；35：生殖過程；36：信號(hào)傳導(dǎo)；37：多細(xì)胞生物過程；38：發(fā)育過程；39：生長；40：運(yùn)動(dòng)；41：單一生物過程；42：生物調(diào)節(jié)；43：刺激反 應(yīng)；44：定位；45：多細(xì)胞生物過程；46：生物調(diào)節(jié)；47：細(xì)胞組成機(jī)制或生物合成。Tips: 1: Extracellular region. 2: Cell. 3: Nucleoid. 4: Membrane. 5: Cell junction. 6: Extracellular matrix. 7: Membrane-enclosed lumen. 8: Macromolecular complex. 9: Organelle. 10: Extracellular matrix part. 11: Extracellular region part. 12: Organelle part. 13: Virion part. 14: Membrane part. 15: Cell part. 16: Protein binding transcription factor activity. 17: Nucleic acid binding transcription factor activity. 18: Catalytic activity. 19: Receptor activity. 20: Guanyl-nucleotide exchange factor activity. 21: Structural molecule activity. 22: Transporter activity. 23: Binding. 24: Electron carrier activity. 25: Antioxidant activity. 26: Metallochaperone activity. 27: Enzyme regulator activity. 28: Nutrient reservoir activity. 29: Molecular transducer activity. 30: Reproduction. 31: Cell killing. 32: Immune system process. 33: Metabolic process. 34: Cellular process. 35: Reproductive process. 36: Signaling. 37: Multicellular organismal process. 38: Developmental process. 39: Growth. 40: Locomotion. 41: Single-organism process. 42: Rhythmic process. 43: Response to stimulus. 44: Localization. 45: Multi-organism process. 46: Biological regulation. 47: Cellular component organization or biogenesis.圖2 差異表達(dá)基因GO功能富集Fig.2 GO function enrichment of differentially expressed genes

2.2 轉(zhuǎn)錄組的功能注釋及轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

基于基因在小花蕾期和始花期2個(gè)樣品中表達(dá)量，對(duì)識(shí)別到的DEGs進(jìn)行功能注釋，使用BLAST軟件將Unigene與Pfam，TrEMBL，eggNOG，Swiss-Prot，GO，KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，44 088個(gè)Unigene獲得注釋信息，27 801個(gè)Unigene被GO數(shù)據(jù)庫注釋，32 528 個(gè)Unigene被eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋，32 781個(gè)Unigene被KEGG數(shù)據(jù)庫注釋。組裝得到的Unigene進(jìn)行FPKM值表達(dá)量統(tǒng)計(jì),2個(gè)樣品測(cè)得4 349 個(gè)DEGs，較小花蕾期1 855個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，較始花期2 494個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能富集

使用Blast2GO軟件對(duì)檢測(cè)到的DEGs進(jìn)行GO功能注釋和富集分析。由圖2可知，DEGs劃分為47個(gè)功能組，包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能三大類。其中6 658個(gè)GO條目屬于生物學(xué)過程，DEGs主要分布于細(xì)胞轉(zhuǎn)化(1 416，9.35%)、代謝過程(1 372，9.06%)、單細(xì)胞生物工程(1 101，7.27%)、生物調(diào)節(jié)(663，4.38%)、刺激反應(yīng)(639，4.22%)；4 989個(gè)GO條目屬于細(xì)胞組成，注釋為細(xì)胞組分(1 651，10.90%)、細(xì)胞器(989，6.53%)、膜組分(759，5.01%)等相關(guān)的DEGs富集較多；3 494個(gè)GO條目屬于分子功能，注釋為結(jié)合(1 453，9.60%)、催化活性(13 83，9.13%)等功能相關(guān)的DEGs較多。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中1 219個(gè)DEGs被KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，涉及166條代謝途徑。DEGs富集排名前五的KEGG通路為苯丙醇生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)(ko00940，68)、淀粉與蔗糖的代謝(starch and sucrose metabolism)(ko00500，41)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)(ko04075，40)、氰氨基酸代謝(cyanoamino acid metabolism)(ko00460，28)、α-亞麻酸代謝(alpha-linolenic acid metabolis)(ko00592，25)；與花色形成緊密相關(guān)的有類黃酮生物合成途徑(flavonoid biosynthesis)(ko00941，10)、黃酮和黃酮醇生物合成途徑(flavone and flavonol biosynthesis)(ko00944，2)、類胡蘿卜生物合成途徑(carotenoid biosynthesis)(ko00906，6)卟啉和葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)(ko00860，1)。

2.5 花色相關(guān)基因表達(dá)分析

根據(jù)差異基因KEGG代謝途徑及基因注釋，從類黃酮、類胡蘿卜素、葉綠素合成代謝途徑，挖掘出與花色相關(guān)的54個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因(表3)和21個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(表4)。由FPKM值可見小花蕾期和始花期2個(gè)樣本基因表達(dá)的差異，始花期樣品中結(jié)構(gòu)基因有24條單基因較小花蕾期上調(diào)，30條單基因下調(diào)；類黃酮雙加氧酶基因(naringenin 3-dioxygenase,F3H)、DFR、ANS、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(cyanidin 3-O-rutinoside 5-O-glucosyltransferase, 3,5GT)、PDS、ZDS、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(cis-β-carotene 9′, 10′-cleaving dioxygenase,CCD7)、葉綠素a合成酶基因(chlorophyll a synthase, CHLG)、葉綠素b還原酶(chlorophyll b reductase，NOL)、葉綠素酶基因(chlorophyllase，CLH)、脫鎂葉綠酸加氧酶基因(pheophorbide a oxygenase，PAO)、順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)均為上調(diào)表達(dá)；PAL、查耳酮異構(gòu)酶基因 (chalcone isomerase,CHI)、類黃酮3′-羥化酶基因(flavonoid 3′-monooxygenase,F3′H)、類黃酮-3',5-羥化酶基因(flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H)、UFGT、花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase, 3GT)、PSY、BCH、ZEP、胡蘿卜素順反異構(gòu)酶基因(carotene cis-trans isomerase, CRTISO)、鎂螯合酶基因(magnesium chelatase subunit H,CHLH)、葉綠素a加氧酶基因(chlorophyllide a oxygenase,CAO)均為下調(diào)表達(dá)；C4H、香豆酸：輔酶A連接酶基因(4-coumarate—CoA ligase, 4CL)、CHS、FLS、花青素雙糖基轉(zhuǎn)移酶基因(anthocyanidin5,3-O-glucosyltransferase, 5,3GT)的表達(dá)量既有上調(diào)也有下調(diào)；類胡蘿卜素合成代謝途徑的關(guān)鍵酶基因除ZDS和CCD7表達(dá)量較高外，其他基因表達(dá)量均較小；葉綠素合成酶基因僅CHLG表達(dá)量上調(diào)，葉綠素降解酶基因均上調(diào)。小花蕾期CHS(Unigene ID:G31409_c2_g1)基因表達(dá)量最高，始花期F3H(Unigene ID:G34942_c5_g1)基因表達(dá)量最高。

與小花蕾期樣品相比，始花期樣品的調(diào)節(jié)基因有8條單基因上調(diào)，13條單基因下調(diào)；通過基因注釋，在樣本中篩選出玉米糊粉層有色基因(coloured aleurone,C1)、玉米種皮有色基因(pericarp color,P)、玉米轉(zhuǎn)錄因子(zeamays1，Zm1)、MYB4、MYB6、外種皮透明基因2(transparent testa 2，TT2)、bHLH13同源性較高的轉(zhuǎn)錄因子，Zm1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量較高；小花蕾期轉(zhuǎn)錄因子MYB306(Unigene ID:G19067_c0_g1)表達(dá)量最高，始花期轉(zhuǎn)錄因子MYB31(Unigene ID:G12396_c0_g1)表達(dá)量最高。

與小花蕾期樣品相比，始花期樣品中花青苷合成下游關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因DFR、ANS、3,5GT及轉(zhuǎn)錄因子Zm1、Hv1、MYB305、MYB31表達(dá)量整體較高，且在始花期均為上調(diào)。在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST花青苷下游合成基因及部分表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)錄因子同源性物種，由表5可見，與DFR、ANS、3GT基因同源性最高的物種均為大花蕙蘭，與5,3GT、3,5GT、Zm1同源性最高的為蝴蝶蘭或石斛蘭，與轉(zhuǎn)錄因子MYB31同源性最高的為墨蘭，與轉(zhuǎn)錄因子Hv1、MYB305、MYB306同源性最高的均為建蘭。

表3 花色關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因差異表達(dá)Table 3 Differential expression of key structural genes related flower color

表3(續(xù))

表4 花色相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)Table 4 Differential expression of transcription factors related flower color

表5 部分花青苷合成關(guān)關(guān)鍵基因的最大同源性物種比對(duì)Table 5 The maximum identity of partial key genes of the synthesis of anthocyanins among species

2.6 部分差異結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄模式驗(yàn)證

對(duì)測(cè)序材料轉(zhuǎn)錄組中類黃酮、類胡蘿卜素代謝途徑的部分結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示所選基因qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)結(jié)果的變化趨勢(shì)一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可信度較高；基因PAL(Unigene ID:G34234_c1_g1)、CHS(Unigene ID:G25338_c1_g1)、F3H(Unigene ID:G34942_c5_g1)、FLS(Unigene ID:G33942_c5_g2)、DFR(Unigene ID:G31003_c2_g3)在小花蕾期和始花期表達(dá)量均較高，其中PAL(Unigene ID:G34234_c1_g1)基因在小花蕾期表達(dá)量最高，DFR(Unigene ID:G31003_c2_g3)基因在始花期表達(dá)量最高；類胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量整體明顯低于類黃酮合成途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量(圖3)。

圖3 花瓣轉(zhuǎn)錄組基因相對(duì)表達(dá)量的qPCR驗(yàn)證Fig.3 qPCR verification of gene relative expression in petal transcription group

2.7 花瓣色素的檢測(cè)

對(duì)試驗(yàn)材料不同發(fā)育期花瓣的色素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示(表6)小花蕾期花瓣花青苷未檢出，始花期總花青苷含量為0.247 9 mg·g-1FW；不同花發(fā)育期各花色素含量均有極顯著差異；總黃酮的含量均高于類胡蘿卜素、葉綠素及總花青苷含量；與小花蕾期花瓣比較，始花期花瓣中類胡蘿卜素、葉綠素及總黃酮含量均降低，僅總花青素苷含量升高。

3 討論

本研究對(duì)2個(gè)不同發(fā)育期的黃金梅花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，2個(gè)樣品Mapped Reads在Clean Reads中所占比例分別為86.83%(A)、88.29%(B)；質(zhì)量值Q20和Q30均大于90%，GC含量均大于47.5%，可見測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。測(cè)序共獲得113 780條Unigene，組裝的Transcript與Unigene平均長度為725.64 bp和586.53 bp，N50分別為1 229 bp和882 bp。李文建等[9]對(duì)同株建蘭黃綠色和紅色花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得106 479條Unigenes，200～300 bp的Unigene比例最高；Transcript與Unigenes的平均長度分別為1 150.14 bp和655.25 bp，N50分別為2 127 bp和1 087 bp，以上測(cè)序數(shù)據(jù)與本研究有一定差異，但GO功能富集分析中各類差異基因占比與本研究結(jié)果有一定趨同性。

表6 不同花發(fā)育期花瓣色素含量Table 6 The content of flower pigment in different flower development stages /(mg·g-1 FW)

花青苷與原花色素、黃酮醇等類黃酮物質(zhì)共享底物及上游代謝路徑，CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、FLS、GT基因是類黃酮合成代謝途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中除ANS基因，其他關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量均較高，推測(cè)ANS基因表達(dá)量較低是花瓣中花青苷含量大幅低于總黃酮含量的主要原因之一；糖基轉(zhuǎn)移酶是生成花色苷的關(guān)鍵酶[29]，本試驗(yàn)篩出多個(gè)花青素單糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)及雙糖基轉(zhuǎn)移酶(3,5GT)基因，特別是矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(3,5GT)在始花期花瓣中表達(dá)量上調(diào)明顯。Huai等[30]研究也認(rèn)為類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶在開花后期表達(dá)強(qiáng)度與花色素合成呈正相關(guān)，推測(cè)黃金梅始花期花瓣為紫紅色，3,5GT酶基因起到了關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中PSY、PDS、ZDS、BCH、ZEP、CCD7、CRTISO、NCED類胡蘿卜素合成代謝途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，除ZDS和CCD7表達(dá)量較高外整體表達(dá)量較低，CCD7為胡蘿卜素裂解酶，其高表達(dá)能導(dǎo)致類胡蘿卜素含量降低，始花期樣品中類胡蘿卜素含量較花青苷含量低，推測(cè)是花瓣表觀呈紫紅色的原因。自然界中綠色花較少，但國蘭特別是春蘭、蕙蘭以綠花為主，試驗(yàn)材料黃金梅母本春蘭也為綠花。而葉綠素是綠色花的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中CHLH、CHLG、CAO基因?yàn)槿~綠素a(chlorophyll a)和葉綠素b(chlorophyll b)的合成酶基因，NOL、CLH、PAO基因?yàn)槿~綠素降解酶基因，從轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量結(jié)果來看，葉綠素合成基因僅CHLG表達(dá)量上調(diào)，而葉綠素降解酶基因均上調(diào)，推測(cè)從小蕾期到始花期花瓣葉綠素合成減緩、代謝增強(qiáng)，因此始花期葉綠素含量明顯降低。

本研究通過基因注釋篩選出了與C1、P、Zm1、MYB4、MYB6、TT2、bHLH13等轉(zhuǎn)錄因子序列,已有研究表明這些轉(zhuǎn)錄因子與花青苷的合成緊密相關(guān)[31-38]，C1、P、Zm1是玉米中與花青苷合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，本研究中Zm1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較高；此外，與花色素合成代謝有關(guān)的Hv1、MYB31、MYB305轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較高，且在始花期上調(diào)，張春玲等[39]認(rèn)為萬壽菊中Hv1與番茄紅素β-環(huán)化酶基因，即類胡蘿卜素的代謝機(jī)制與葉黃素含量的調(diào)控有關(guān)，F(xiàn)ornalé等[40]研究認(rèn)為玉米中MYB31參與了類苯丙烷基因的調(diào)控；Liu等[41]和Wang等[29]認(rèn)為MYB305調(diào)節(jié)類黃酮代謝基因的表達(dá)；本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中MYB306轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平較高，且在始花期下調(diào)，有研究指出，MYB306 的表達(dá)參與調(diào)控花青苷、總黃酮、酚類物質(zhì)合成等生理代謝[42-44]，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能將在后續(xù)研究進(jìn)行重點(diǎn)驗(yàn)證。

本研究材料黃金梅的母本為綠花品種大宋梅，父本為黃花品種黃金虎，雜交后代黃金梅花瓣顯紫紅色，分析其花青苷合成的下游關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和部分轉(zhuǎn)錄因子，BLAST分析發(fā)現(xiàn)與DFR、ANS、3GT基因同源性最高的物種均為大花蕙蘭，推測(cè)基因與父本同源性高；與花青苷雙糖基轉(zhuǎn)移酶基因(5,3GT、3,5GT)同源性最高的為蝴蝶蘭或石斛蘭，與轉(zhuǎn)錄因子MYB31同源性最高的為墨蘭，Hv1、MYB305、MYB306同源性最高的均為建蘭，推測(cè)部分基因與母本同源性高；黃金梅顯色的原因是否為父母花青苷結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的互補(bǔ)或重組，可進(jìn)一步通過春蘭全基因組測(cè)序結(jié)果作驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通對(duì)黃金梅不同發(fā)育期花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，獲得44 088個(gè)Unigene注釋信息；ANS和GT基因的表達(dá)在花青苷合成代謝中起到了關(guān)鍵調(diào)控作用；紅花的呈色主要由花青苷決定，與黃金梅DFR、ANS、3GT基因同源性最高的物種均為大花蕙蘭，與花青苷雙糖基轉(zhuǎn)移酶基因(5,3GT、3,5GT)同源性最高的為蝴蝶蘭或石斛蘭，與轉(zhuǎn)錄因子MYB31同源性最高的為墨蘭，與Hv1、MYB305、MYB306同源性最高的均為建蘭。本研究為下一步花色基因的克隆、功能分析及分子調(diào)控機(jī)理的解析提供了一定參考。