何樹(shù)華,龐向東,張又丹,江虹

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶， 408100)

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，越來(lái)越多的養(yǎng)殖戶(hù)把抗病毒藥物用于預(yù)防和治療畜禽病毒感染。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部早在2005年10 月針對(duì)抗病毒藥物發(fā)布了“第 560 號(hào)”公告，明確指出，“金剛烷胺類(lèi)等人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用于動(dòng)物病毒性疫病不但給動(dòng)物疫病控制帶來(lái)不良后果，而且影響國(guó)家動(dòng)物疫病防控政策的實(shí)施”。但近年仍有些不法商販，為了高利潤(rùn)和高回報(bào)，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，將某些人用的具有較好療效的抗病毒藥物(如利巴韋林、拉米夫定、阿昔洛韋等)非法用在畜禽動(dòng)物上，由此產(chǎn)生的藥物殘留不僅影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，而且對(duì)人們的健康帶來(lái)危害。對(duì)于動(dòng)物源性食品中殘留抗病毒藥物，我國(guó)目前尚無(wú)法定檢測(cè)方法。

拉米夫定檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-8]和高效液相色譜法[9-15]，偶見(jiàn)分光光度法[16-17]和電化學(xué)法[18]。前兩種方法雖有高的準(zhǔn)確度，但存在前處理操作繁瑣、重現(xiàn)性較差，且運(yùn)行和維護(hù)費(fèi)用高等不足；分光光度法雖簡(jiǎn)便，但靈敏度較低；電化學(xué)法因需特殊電極材料，條件較為苛刻；共振光散射法是新近發(fā)展起來(lái)的一種用于微量和痕量檢測(cè)的高靈敏分析技術(shù)，盡管在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用較多[19]，但未見(jiàn)用于畜禽肉食中拉米夫定的藥殘分析。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在弱堿性溶液中，用溴代鯨蠟基吡啶增敏剛果紅后，與拉米夫定以靜電引力結(jié)合生成的離子締合物的共振光散射(resonance light scattering,RLS)增強(qiáng)強(qiáng)度(ΔIRLS)與拉米夫定濃度間有一定的線(xiàn)性關(guān)系，本研究將其用于畜禽肉中的藥物殘留分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拉米夫定(lami udine)對(duì)照品：99.7%～99.9%，批號(hào) 101007-201502，中國(guó)食品藥品檢定研究院；剛果紅(congo red)：99%，上海寶曼生物科技有限公司；氨丁三醇(TRIS)：99%，河南天孚化工有限公司；鹽酸：分析純，重慶華東化工有限公司；溴代鯨蠟基吡啶(cetylpyridinium bromide)：99%，武漢易泰科技有限公司上海分公司；水：超純水(自制，成都優(yōu)普超純水儀)。

豬肉(1#～3#)、雞肉(4#)：購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(jì)(F-2500 型)，日本日立公司(設(shè)λex=λem=220 nm，測(cè)定狹縫5.0 nm)；超聲波清洗機(jī)(KQ-200 DE 型)，昆山市超聲儀器有限公司；精密酸度計(jì)(pHS-3C型)，上海理達(dá)儀器廠(chǎng)。

1.3 溶液的配制

拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱(chēng)取拉米夫定對(duì)照品適量(準(zhǔn)至±0.100 0 mg)，加適量水溶解完全后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容，配成229.3 mg/L 貯備液，操作液為2.293 mg/L，存于4 ℃冰箱中。剛果紅溶液：0.100 mmol/L 水溶液。溴代鯨蠟基吡啶溶液：500 mg/L水溶液。TRIS 溶液：200 mmol/L水溶液。鹽酸溶液：100 mmol/L水溶液。TRIS-鹽酸溶液：pH 3.2～9.5(用酸度計(jì)測(cè)定鹽酸溶液與TRIS溶液混合液的pH 值)。

1.4 樣品處理

取生鮮豬肉(1#、2#和3#)及現(xiàn)殺雞肉(4#)，去皮、洗凈、攪成肉末。準(zhǔn)確稱(chēng)取各肉末樣20 g 左右(精確至±0.100 0 mg)分別置于燒杯中，加適量水，于40 ℃熱水浴中超聲提取30 min，取出，離心分離(4 000 r/min)，將離心液置于另一燒杯中，剩余部分重復(fù)提取1次，將2次上清液合并，加入20 mL 甲醇，在80 ℃恒溫水浴中提取30 min(拉米夫定在熱溶液中穩(wěn)定[20]，而蛋白質(zhì)變性沉淀)，離心分離，清液于通風(fēng)櫥內(nèi)100 ℃水浴濃縮至適量，冷卻后轉(zhuǎn)至10.0 mL 比色管中，用水定容備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

精密移取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液0～1.20 mL 于10 mL 比色管中，加入0.100 mmol/L 剛果紅溶液2.50 mL，pH 7.63 TRIS-鹽酸溶液2.00 mL，搖勻，再加入500 mg/L溴代鯨蠟基吡啶溶液0.50 mL，搖勻后用水定容至10 mL。不斷搖動(dòng)，待充分反應(yīng)10 min 后，在熒光儀上掃描共振光散射(RLS)光譜，測(cè)定398 nm 處的RLS 強(qiáng)度(IRLS)及試劑空白的RLS 強(qiáng)度(I0)，求出溶液的共振光散射增強(qiáng)強(qiáng)度ΔIRLS(=IRLS-I0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TRIS-鹽酸溶液的反應(yīng)條件

2.1.1 溶液的pH 及用量

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL、剛果紅溶液及溴代鯨蠟基吡啶溶液分別為2.00 mL和0.10 mL 時(shí)，考察了398 nm 處，pH 3.2～9.5 范圍內(nèi)不同pH下的TRIS-鹽酸溶液對(duì)體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖1-a可知，體系反應(yīng)的適宜pH在 7.2～8.2，超出該范圍，ΔIRLS值均有下降(原因：當(dāng)pH<7.2，尤其溶液處于酸性范圍時(shí)，反應(yīng)不能完全；當(dāng)pH>8.2，溶液的堿性逐漸增強(qiáng)時(shí)，反應(yīng)也不能完全)。故實(shí)驗(yàn)選用pH 7.63 的TRIS-鹽酸溶液。從圖1-b可知，pH 7.63 溶液的最佳用量為2.00 mL。故后續(xù)選定TRIS-鹽酸溶液的pH為7.63，用量為2.00 mL。

圖1 TRIS-鹽酸溶液的pH 及用量對(duì)ΔIRLS的影響Fig.1 Effect of the pH and dosage of TRIS-HCl solution on the ΔIRLS

2.1.2 剛果紅溶液濃度

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液和溴代鯨蠟基吡啶溶液與2.1.1 項(xiàng)相同，所取TRIS-鹽酸溶液為選定的最佳條件(即2.00 mL,pH 7.63)時(shí)，考察了398 nm 處，0.50～3.00 mL 范圍內(nèi)的剛果紅溶液對(duì)體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖2 可知，0.100 mmol/L 剛果紅溶液的最佳用量為2.50 mL，大于或小于該值，反應(yīng)的ΔIRLS均有下降(原因：當(dāng)剛果紅溶液取量小于2.50 mL 時(shí)，因用量不足，反應(yīng)不能達(dá)到完全；當(dāng)剛果紅溶液取量大于2.50 mL 時(shí)，因該液過(guò)量，剛果紅自身的聚集也會(huì)使反應(yīng)不完全)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇剛果紅濃度為0.100 mmol/L，用量為2.50 mL。

圖2 剛果紅用量對(duì)ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of congo red dosage on the ΔIRLS

2.1.3 溴代鯨蠟基吡啶溶液用量

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL，所取剛果紅溶液和TRIS-鹽酸溶液為上述選定的最佳條件時(shí)，考察了398 nm 處，0.10～0.70 mL 范圍內(nèi)的500 mg/L溴代鯨蠟基吡啶溶液對(duì)體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖3 可知，溴代鯨蠟基吡啶溶液的最佳用量為0.50 mL，大于或小于該值，靈敏度均不能達(dá)最高。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用的溴代鯨蠟基吡啶的用量為0.50 mL。

圖3 溴代鯨蠟基吡啶用量對(duì)ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of 1-hexadecylpyridinium bromide dosage on the ΔIRLS

2.1.4 試劑加入順序

在拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液及前述選定的TRIS-鹽酸、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶溶液的條件固定不變時(shí)，考察這幾種物質(zhì)在加入順序不同時(shí)，對(duì)反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。結(jié)果顯示，體系反應(yīng)最完全、靈敏度相對(duì)最高的加入順序?yàn)椋豪追蚨?、TRIS-鹽酸、剛果紅、溴代鯨蠟基吡啶(ΔIRLS=165)。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間

在物質(zhì)的最佳加入順序及最佳反應(yīng)條件下，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。結(jié)果表明，拉米夫定、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶在弱堿性溶液中，10 min 內(nèi)即可反應(yīng)完全(從反應(yīng)開(kāi)始至10 min 內(nèi)，ΔIRLS隨反應(yīng)時(shí)間的增加逐漸增大)，反應(yīng)達(dá)10 min 時(shí)，ΔIRLS達(dá)最大；10～70 min內(nèi)，ΔIRLS基本穩(wěn)定；70 min 后，ΔIRLS有降低趨勢(shì)。故實(shí)驗(yàn)選在反應(yīng)10 min 后的穩(wěn)定區(qū)進(jìn)行。

2.2 共振光散射光譜特征

拉米夫定、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶的共振光散射光譜見(jiàn)圖4。拉米夫定因分子結(jié)構(gòu)上氨氮的孤對(duì)電子可接受質(zhì)子，使其在溶液中以陽(yáng)離子形式存在；剛果紅是一種雙偶氮的酸性染料，分子結(jié)構(gòu)上含有2 個(gè)磺酸根，使其在溶液中以陰離子形式存在；溴代鯨蠟基吡啶是一種陽(yáng)離子表面活性劑，在溶液中以陽(yáng)離子形式存在。當(dāng)拉米夫定與剛果紅在弱堿性溶液中混合時(shí)，從結(jié)構(gòu)式可知，他們可以以靜電結(jié)合生成離子締合物，但從圖4的光譜曲線(xiàn)6 可知，該締合物的共振光散射信號(hào)較弱(拉米夫定和剛果紅自身的RLS 信號(hào)很弱，見(jiàn)曲線(xiàn)1 和曲線(xiàn)2)，不宜進(jìn)行拉米夫定的定量分析。從曲線(xiàn)3、4、5可知，溴代鯨蠟基吡啶或其在弱堿性溶液中的RLS 信號(hào)很弱，剛果紅的弱堿性溶液的RLS 信號(hào)也很弱，但如果將剛果紅的弱堿性溶液與溴代鯨蠟基吡啶混合后，其RLS 信號(hào)將明顯增強(qiáng)(曲線(xiàn)7)，這種現(xiàn)象說(shuō)明陽(yáng)離子表面活性劑溴代鯨蠟基吡啶可以增敏剛果紅，并產(chǎn)生新的RLS 光譜，他的特征最大RLS 峰位于398 nm，在450～520 nm 范圍內(nèi)有多個(gè)較小的RLS 峰。從曲線(xiàn)7～13 可知，當(dāng)在曲線(xiàn)7 的溶液中加入不同質(zhì)量濃度的拉米夫定后，其RLS 信號(hào)隨著拉米夫定濃度的增大而增強(qiáng)，但只有在最大峰398 nm 處，其RLS 信號(hào)與拉米夫定的質(zhì)量濃度有線(xiàn)性關(guān)系，因此選擇398 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)，用于定量檢測(cè)拉米夫定。

從譜線(xiàn)和物質(zhì)結(jié)構(gòu)可知，他們的可能反應(yīng)機(jī)理及RLS 增強(qiáng)原因?yàn)椋涸趯?shí)驗(yàn)條件下，帶正電荷的溴代鯨蠟基吡啶以預(yù)膠束聚集態(tài)與以陰離子形式存在的剛果紅分子通過(guò)靜電作用生成分子體積更大的復(fù)雜聚集體，從而使共振光散射明顯增強(qiáng)；當(dāng)有拉米夫定存在時(shí)，由于分子結(jié)構(gòu)上氨氮孤對(duì)電子可接受質(zhì)子，于是與帶負(fù)電荷的締合顆粒(剛果紅-溴代鯨蠟基吡啶)進(jìn)一步以靜電作用生成電中性的三元締合物，新聚集體的摩爾質(zhì)量和體積變得更大，從而使共振光散射增強(qiáng)。

1-拉米夫定(0.229 mg/L); 2-剛果紅(0.025 0 mmol/L); 3-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L); 4-剛果紅(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 5-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63; 6-拉米夫定(0.229 mg/L)-剛果紅(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 7～13-拉米夫定(0.00、0.045 9、0.091 7、0.138、0.183、0.229、0.275 mg/L)-剛果紅(0.025 0 mmol/L)-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63圖4 拉米夫定-剛果紅-溴代鯨蠟基吡啶的共振光散射光譜Fig.4 Resonance light scattering spectra of lami udine-congo red-cetylpyridinium bromide

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及靈敏度

精密移取2.293 mg/L 拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于10 mL 比色管中，按最佳加入順序和反應(yīng)條件，加入剛果紅、TRIS-鹽酸及溴代鯨蠟基吡啶溶液，用水定容。按照1.5 小節(jié)的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的ΔIRLS，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。曲線(xiàn)的回歸方程為ΔIRLS=-2.320 4 + 696.96ρ，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，線(xiàn)性范圍為0.006～0.28 mg/L，檢出限為0.009 5 mg/kg，定量限為0.032 mg/kg。

2.3.2 選擇性

2.3.3 樣品測(cè)定、準(zhǔn)確度及精密度

取1.4 小節(jié)制得的待測(cè)樣液各3.00 mL(各平行5 份)，按試劑的最佳加入順序及反應(yīng)條件加入剛果紅、TRIS-鹽酸及溴代鯨蠟基吡啶溶液，用水定容至10 mL。按照1.5小節(jié)的方法測(cè)定ΔIRLS，再由回歸方程求得待測(cè)液中拉米夫定的含量，從而求得殘留于生鮮豬肉及雞肉中拉米夫定的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。同時(shí)，用另一具有較高靈敏度的吸收光譜法(簡(jiǎn)寫(xiě)為 IS 法)進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。結(jié)果表明，2種方法測(cè)定結(jié)果相同(均未檢出殘留拉米夫定，見(jiàn)表1，即可將其含量看作0)，由統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)

為了進(jìn)一步判斷新方法的準(zhǔn)確度和精密度，對(duì)不同樣品作低、中、高3 種加標(biāo)水平(各水平做5 份平行試驗(yàn))的回收試驗(yàn)(即準(zhǔn)確稱(chēng)取空白肉末20 g 左右，加適量拉米夫定貯備液，再加適量二次水，后續(xù)處理同1.4小節(jié)，最終制得樣加標(biāo)待測(cè)液)。照1.5小節(jié)的方法，取樣加標(biāo)待測(cè)液，測(cè)定其拉米夫定總含量，再求出回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即可判斷新方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 畜禽肉樣的分析結(jié)果及回收試驗(yàn)Table 1 Results and reco ery tests of li estock and poultry meat samples (n=5)

實(shí)驗(yàn)表明，所購(gòu)生鮮豬肉及雞肉中未檢測(cè)出殘留抗病毒藥物——拉米夫定，說(shuō)明該畜禽產(chǎn)品質(zhì)量符合要求。

3 結(jié)論

以溴代鯨蠟基吡啶增敏剛果紅測(cè)定拉米夫定的共振光散射法除具有很高的靈敏度外，還有很好的選擇性、良好的線(xiàn)性關(guān)系及較寬的線(xiàn)性范圍，準(zhǔn)確度和精密度滿(mǎn)足痕量分析要求，樣品處理簡(jiǎn)單、安全，成本低，適于生鮮豬肉及現(xiàn)殺雞肉中拉米夫定的藥殘分析。