秦海彬，牛坤，王遠(yuǎn)山*

1(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014) 2(生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)存在于各種生物組織內(nèi)，具有廣泛的生物學(xué)功能[1]，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、多糖、磷脂以及脂肪酸等物質(zhì)的生物合成[2-3]。SAM作為標(biāo)準(zhǔn)藥物的替代品對治療抑郁癥、骨關(guān)節(jié)炎、酒精性肝病和阿爾茲海默病具有相當(dāng)大的優(yōu)勢，市場需求巨大[4]。

SAM的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法，其中化學(xué)法合成產(chǎn)率低，反應(yīng)底物L(fēng)-半胱氨酸價(jià)格昂貴，且分離與純化過程困難，難以工業(yè)化應(yīng)用[5]。酶促轉(zhuǎn)化法需要SAM合成酶并添加價(jià)格昂貴的底物ATP，因其生產(chǎn)投入較高而缺乏市場競爭力。發(fā)酵法生產(chǎn)SAM具有工藝流程簡單、產(chǎn)量高、底物廉價(jià)易得等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用[6]。目前，已報(bào)道生產(chǎn)SAM的微生物主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和釀酒酵母(Saccharomycescere isiae)。通過同源或異源過表達(dá)SAM合成酶可以提高大腸桿菌SAM產(chǎn)量，但是過多的SAM積累不利于菌體生長。重組畢赤酵母生產(chǎn)SAM需要甲醇作為誘導(dǎo)劑，可能引起安全問題，并且發(fā)酵周期長。與上述2種微生物相比，釀酒酵母作為安全生物廣泛應(yīng)用于食品與發(fā)酵行業(yè)，且SAM合成能力強(qiáng)，適宜作為SAM工業(yè)生產(chǎn)的菌株[7]。

在傳統(tǒng)的產(chǎn)SAM菌株選育方面，SHIOZAKI等[8]篩選到1株野生釀酒酵母，在最適條件下通過發(fā)酵罐培養(yǎng)，SAM產(chǎn)量達(dá)到10.8 g/L，這是迄今在野生菌發(fā)酵產(chǎn)SAM方面最高的報(bào)道。利用化學(xué)誘變(NTG、EMS、LiCl等)、物理誘變(60Co γ-射線、U 等)以及復(fù)合誘變篩選SAM產(chǎn)菌株高也有較多報(bào)道，HUANG等[9]利用太空育種方法獲得釀酒酵母突變株H5M147，SAM產(chǎn)量達(dá)到1.22 g/L，是原始菌株的1.87倍。CAO等[10]用紫外連續(xù)誘變結(jié)合乙硫氨酸抗性篩選的方法，得到SAM高活性合成酶的釀酒酵母CGMCC2842，與出發(fā)菌株相比SAM產(chǎn)量增加了2.7倍，同時(shí)在15 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵36 h后SAM產(chǎn)量達(dá)到6.1 g/L。為獲得SAM高效生產(chǎn)菌株，本實(shí)驗(yàn)擬采用常溫常壓等離體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和137Cs γ-射線誘變結(jié)合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板篩選，并通過搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化，5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵，為發(fā)酵法生產(chǎn)SAM奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要材料、試劑與儀器

Saccharomycescere isiaeZY由本實(shí)驗(yàn)室保藏。SAM標(biāo)準(zhǔn)品、乙硫氨酸、制霉菌素、生物素、泛酸鈣、維生素B1、維生素B6,阿拉丁公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

ARTP-II型等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Waters 1525高效液相色譜，美國WATERS公司；spectraMax M5酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司；5 L BIOTECH發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然。固體培養(yǎng)基再加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 5，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，MgSO40.2，CaCl20.1，CuSO40.001 6，檸檬酸三鈉二水合物 0.1，pH自然，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 3，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.6，MgSO43，CaCl20.5，CuSO40.001 6，鉬酸銨 0.004 8，NaCl 0.5，生物素 0.000 3，泛酸鈣 0.003 6，維生素B1 0.003 6，維生素B6 0.003 6。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵罐流加培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 500，酵母粉12。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)菌種活化及種子培養(yǎng)。取菌種甘油管涂布于固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落接入裝有10 mL種子培養(yǎng)基的試管中， 30 ℃，150 r/min培養(yǎng)12 h。活化結(jié)束后以2%的接種量接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)12 h。

(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。250 mL搖瓶中裝液量為50 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，以4%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種，30 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，補(bǔ)加2 mL 36 g/LL-蛋氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

(3)5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵罐裝液量為3 L，經(jīng)過空消、實(shí)消滅菌后，種子培養(yǎng)基以10%(體積分?jǐn)?shù))接種到發(fā)酵罐中?？刂茰囟?、pH，罐壓調(diào)控在0.05 MPa，以200 r/min的攪拌速度開始發(fā)酵，發(fā)酵全程通過控制攪拌轉(zhuǎn)速與葡萄糖流加速度，使溶氧保持在10%～20%，最高轉(zhuǎn)速為750 r/min。發(fā)酵過程中每隔2～3 h取樣，測定還原糖、菌體量、SAM含量等參數(shù)。

1.2.2 誘變方法

(1)ARTP誘變。試驗(yàn)工作氣體為氦氣，工作氣流量為8 SLM，處理距離為2 mm，電源輸出功率為120 W。將培養(yǎng)6～8 h的菌體適當(dāng)稀釋后制備菌懸液，取5 μL菌液加5 μL 10%的甘油均勻涂于載片，80%～90%致死率劑量照射。照射后用無菌培養(yǎng)基清洗載片，洗液適當(dāng)稀釋涂布篩選平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，選擇較大單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

致死率/%=

(1)

(2)137Cs γ-射線誘變。在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心進(jìn)行，將培養(yǎng)6～8 h的菌體適當(dāng)稀釋后制備菌懸液，80%～90%致死率劑量照射。照射后的菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋處理涂布篩選平板，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，選擇較大單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 突變株篩選方法

(1)ARTP誘變與乙硫氨酸抗性平板篩選。蛋氨酸在SAM合成酶與ATP的作用下轉(zhuǎn)化為SAM，但在蛋氨酸類似物如乙硫氨酸的存在下該反應(yīng)會(huì)被抑制，使用乙硫氨酸篩選高耐受突變株，有利于SAM產(chǎn)量的提高[11]。本實(shí)驗(yàn)將ARTP照射后的菌液適當(dāng)稀釋后涂布于0.4 mmol/L乙硫氨酸篩選平板，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，選擇較大單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

(2)137Cs γ-射線誘變與制霉菌素抗性平板篩選。SAM是酵母菌合成麥角固醇的主要甲基供體且消耗量大，而制霉菌素能夠結(jié)合酵母菌細(xì)胞膜上的麥角固醇，導(dǎo)致麥角固醇產(chǎn)生途徑缺失，細(xì)胞膜通透性改變。理論上，制霉菌素可以用來選育高產(chǎn)SAM菌株[12]。將γ-射線照射后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋涂布于5 μg/mL制霉菌素篩選平板，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，選擇較大單菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 測定方法

(1)生物量測定。菌體干重(dry cell weight，DCW)的測定：烘干至恒重的離心管稱重(m1)，加入固定體積的發(fā)酵液，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用蒸餾水清洗后離心，重復(fù)2次。然后85 ℃烘干至恒重后稱重(m2)，m2-m1為菌體干重，經(jīng)換算可得每升發(fā)酵液的菌體干重。

(2)SAM含量的測定。采用高效液相色譜法[13]。取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min高速離心2 min，棄上清液，加入200 μL超純水，200 μL乙酸乙酯，30 ℃金屬浴振蕩30 min，隨后加入500 μL 0.35 mol/L硫酸，振蕩1.5 h后12 000 r/min離心2 min，取上清液，0.22 μm有機(jī)膜過濾待測。

液相測定條件：色譜柱J&K C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為40 mmol/L 磷酸二氫銨，2 mmol/L庚烷磺酸鈉和18%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

(3)葡萄糖含量測定。3,5-二硝基水楊酸法[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)菌株篩選

2.1.1 菌株ZY生長曲線與最佳照射劑量的確定

對釀酒酵母進(jìn)行ARTP誘變時(shí)，一般使用對數(shù)生長中后期的菌體進(jìn)行誘變，由于此時(shí)菌株酶活力高，生長旺盛且易發(fā)生突變[15]。每隔2 h取樣測600 nm吸光值(OD600)繪制菌株ZY生長曲線。由圖1可知，菌株對數(shù)期生長期在4～12 h，確定培養(yǎng)6～8 h的酵母細(xì)胞進(jìn)行ARTP誘變與137Cs γ-射線誘變。經(jīng)過照射時(shí)間和劑量的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)ARTP照射180 s致死率在87.4%，由于誘變的致死率在80%～90%之間時(shí)，突變率相對較高，獲得優(yōu)良性能菌株的可能性最大[16]，故實(shí)驗(yàn)選擇ARTP誘變照射時(shí)間為180 s。取ARTP照射后的優(yōu)勢菌株，進(jìn)行γ-射線輻照，照射劑量700 GY時(shí)致死率在87%，故實(shí)驗(yàn)選擇γ-射線誘變照射劑量為700 GY。

圖1 ZY菌株搖瓶生長曲線Fig.1 Growth cur e of strain ZY in shake flask fermentation

2.1.2 ARTP誘變育種結(jié)果

ARTP照射菌株ZY 180 s，培養(yǎng)后涂布于乙硫氨酸篩選平板，挑選相對較大的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。經(jīng)過5輪誘變，共獲得比出發(fā)菌株SAM產(chǎn)量高20% 的突變株23株。通過搖瓶復(fù)篩，突變株A-17的SAM產(chǎn)量最高，較出發(fā)菌株ZY提高了55.5%(表1)。因此，選擇突變株A-17為進(jìn)一步誘變的出發(fā)菌株。

表1 ARTP誘變復(fù)篩結(jié)果Table 1 The rescreening results of ARTP mutagenesis

2.1.3137Cs γ-射線誘變育種結(jié)果

突變株A-17經(jīng)700 GY γ-射線照射4輪，共獲得比出發(fā)菌株SAM產(chǎn)量高20% 的突變株11株。通過搖瓶復(fù)篩，突變株AC-4、AC-6和AC-10的SAM產(chǎn)量提升較高，其中突變株AC-10的SAM產(chǎn)量達(dá)到1.15 g/L，比突變株A-17提高了36.9%，比菌株ZY提高了130.0%(表2)。

表2 137Cs γ-射線誘變復(fù)篩結(jié)果Table 2 The rescreening results of 137Cs γ-mutagenesis

2.1.4 突變株遺傳穩(wěn)定性

為考察突變株傳代后發(fā)酵水平穩(wěn)定性，采用平板劃線方法傳代培養(yǎng)，將復(fù)篩的突變株AC-4、AC-6和AC-10各傳代10次。挑取偶數(shù)代檢測SAM含量，結(jié)果見圖2。與突變株AC-4和AC-6相比，突變株AC-10的SAM產(chǎn)量較高且能穩(wěn)定遺傳，因此選作SAM的生產(chǎn)菌株。

圖2 突變株AC-4、AC-6和AC-10遺傳穩(wěn)定性Fig.2 The inherit stability of mutant AC-4,AC-6 and AC-10

2.1.5 突變株AC-10搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.5.1 培養(yǎng)溫度的確定

考查了24、27、30、33和36 ℃對突變株AC-10生長和SAM產(chǎn)量的影響。由圖3可知，溫度對菌體量無顯著影響，而對SAM產(chǎn)量有顯著影響。30 ℃時(shí)菌體量和SAM產(chǎn)量都達(dá)到最大，分別為7.19 g/L和1.16 g/L，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，SAM產(chǎn)量則降低。綜合SAM產(chǎn)量和菌體量，選擇30 ℃為最適培養(yǎng)溫度。

圖3 溫度對突變株AC-10生長和SAM生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of temperature on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.5.2 初始pH的確定

pH會(huì)對菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)、參與代謝的各種酶活性力產(chǎn)生較大影響，間接影響菌體對培養(yǎng)基的利用，菌體的生長以及產(chǎn)物的生成[17]。在30 ℃下研究了不同初始pH值對突變株AC-10生長和SAM產(chǎn)量的影響。由圖4可知，初始pH由4.5提高到7.5的過程中，SAM產(chǎn)量和生物量變化顯著，且偏酸性環(huán)境有利于菌體生長和SAM生成，初始pH為5.5時(shí)菌體量及SAM產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為7.24 g/L和1.21 g/L。因此，選擇初始pH 5.5為最適pH。

圖4 初始pH對突變株AC-10生長和SAM生產(chǎn)的影響Fig.4 Effect of initial pH on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.6 突變株AC-10 5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

在5 L發(fā)酵罐中溫度控制30 ℃，用氨水調(diào)節(jié)pH至5.5，以分批補(bǔ)料方式考查突變株AC-10產(chǎn)SAM的能力，其發(fā)酵曲線見圖5。整個(gè)發(fā)酵過程可分為適應(yīng)期、快速生長期和轉(zhuǎn)化期3個(gè)階段。發(fā)酵前期，菌株生長緩慢，糖耗低，培養(yǎng)至15 h葡萄糖基本耗完，溶氧迅速升高，此時(shí)開始流加培養(yǎng)基，起始流加速度10 mL/h，其中葡萄糖流加濃度約為2.5 g/(L·h)。15 h后菌株生長迅速，糖耗高，通過調(diào)節(jié)流加速度，使罐內(nèi)殘?zhí)强刂圃? g/L左右。配合轉(zhuǎn)速與通氣量調(diào)節(jié)，使溶氧保持在10%～20%。參考王杰鵬等[18]]蛋氨酸補(bǔ)加策略，當(dāng)菌體量達(dá)到100 g/L時(shí)開始補(bǔ)加蛋氨酸。52 h時(shí)加入8 gL-蛋氨酸作為前體，此后每隔4 h補(bǔ)加一次。在L-蛋氨酸加入之前，胞內(nèi)幾乎沒有SAM積累，在加入后則快速生成，在第68 h SAM產(chǎn)量達(dá)到5.62 g/L，最高產(chǎn)率為0.63 g/(L·h)。

圖5 AC-10突變株5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵曲線Fig.5 Time course of fed-batch fermentation by mutant AC-10

突變株AC-10在菌體量和SAM產(chǎn)量方面比原始菌株均有所提高，搖瓶中SAM最高產(chǎn)量為1.21 g/L，經(jīng)5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵，SAM產(chǎn)量可達(dá)5.62 g/L，與HUANG等[9]、CAO等[10]報(bào)道的SAM產(chǎn)量基本持平。突變株AC-10在52～62 h最高SAM產(chǎn)率為0.63 g/(L·h)，但62 h后生長明顯停滯，原因可能是營養(yǎng)物質(zhì)匱乏間接導(dǎo)致SAM產(chǎn)量降低。參考釀酒酵母發(fā)酵SAM的報(bào)道，如LI等[19]以突變株釀釀酒酵母CGMCC 13760利用豆腐黃漿液發(fā)酵SAM，在優(yōu)化的工藝條件下，產(chǎn)量達(dá)到16.14 g/L;王杰鵬等[20]通過釀酒酵母SAM0801高密度發(fā)酵SAM，在優(yōu)化的工藝條件下，SAM產(chǎn)量達(dá)到17.1 g/L;而LIU等[21]使用CRISPR工具整合外源基因獲得重組釀酒酵母HDL-R2菌株，通過蛋氨酸補(bǔ)加策略優(yōu)化，SAM產(chǎn)量達(dá)到10.3 g/L。因此，突變株AC-10仍有進(jìn)一步發(fā)掘的潛力，后續(xù)可通過發(fā)酵工藝優(yōu)化達(dá)到高密度發(fā)酵、蛋氨酸添加策略優(yōu)化或遺傳改造，進(jìn)一步提高其SAM產(chǎn)量。

3 結(jié)論

針對S.cere isiaeZY發(fā)酵生產(chǎn)SAM產(chǎn)量低的問題，對其進(jìn)行了5輪ARTP誘變和4輪137Csγ-射線輻照誘變，結(jié)合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板篩選，獲得1株遺傳穩(wěn)定性較好的突變株AC-10，其SAM產(chǎn)量為1.15 g/L，與出發(fā)菌株ZY相比提高了130.0%。通過搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定最適條件為30 ℃、初始pH 5.5，經(jīng)5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵68 h后SAM產(chǎn)量達(dá)到5.62 g/L。結(jié)果表明,ARTP與137Csγ-射線突變率高，易獲得遺傳穩(wěn)定性良好突變株，結(jié)合乙硫氨酸、制霉菌素抗性的理性化篩選育種，能夠提高篩選效率。本研究可為發(fā)酵法生產(chǎn)SAM奠定基礎(chǔ)。