莊子瑜，劉春瑩，李秋宏，李鵬飛，徐龍權(quán)，魚紅閃*

1(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622)2(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034) 3(大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連，116021)

人參的主要活性成分為皂苷，目前從人參中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過150種人參皂苷[1]，其中最主要的皂苷是Rb1,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占人參總皂苷的20%、西洋參總皂苷的38%和三七總皂苷的23%[2]。人參皂苷Rb1具有抗氧化、抗心率失常、保護(hù)神經(jīng)、降血糖、提高免疫力和抗癌等作用[3～10]。很多研究表明，人參皂苷活性與皂苷分子糖基數(shù)量密切相關(guān)，皂苷糖基數(shù)量越多，其活性越低；而糖基較少的稀有人參皂苷則具有更高的生理活性[11-14]。人參皂苷Rb1分子帶3-O-Glc-Glc-糖基和20-O-Glc-Glc-糖基等4個糖基，因此，Rb1藥理活性低于帶3個糖基的稀有皂苷Gyp17，更低于帶2個糖基的稀有皂苷Gyp75[3,15]。然而，白參中幾乎不含稀有皂苷Gyp17和Gyp75[3,15]；絞股藍(lán)中含有少量的稀有皂苷Gyp17和Gyp75，但從中分離稀有皂苷Gyp17和Gyp75，操作繁瑣且收率低[16]。因此，利用人參中含量高的Rb1皂苷，通過酶轉(zhuǎn)化制備Gyp17和Gyp75稀有皂苷，對開發(fā)人參成分的保健食品、化妝品和藥物具有重要意義。

為了利用人參中含量高的低活性Rb1皂苷得到高活性稀有皂苷，本課題組利用黑曲霉的人參皂苷酶I型，對Rb1等人參二醇類皂苷進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，其主要產(chǎn)物為人參稀有皂苷C-K和少量F2，不產(chǎn)Gyp17和Gyp75稀有皂苷[17]；利用從微生物中得到的α-L-鼠李糖苷酶，嘗試酶轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷，該酶只能將絞股藍(lán)皂苷-5轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，不產(chǎn)Gyp17和Gyp75稀有皂苷[17]。本課題組又與韓國林完澤教授團(tuán)隊合作，從Terrabacterginsenosidimutans中得到人參皂苷酶基因(bgpA：1 947 bp)，在Escherichiacoli中克隆表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因酶，其分子質(zhì)量為72 kDa；該酶能水解Rb1和Rb2等人參二醇皂苷的3-O-葡萄糖基，轉(zhuǎn)化為Gyp17和Gyp75、C-O和C-Y等稀有皂苷，將其命名為人參皂苷酶III型[18-20]。

本文利用上述E.coli克隆表達(dá)的人參皂苷酶III型，以人參中含量高的皂苷Rb1為底物，酶轉(zhuǎn)化高效制備稀有皂苷Gyp17和Gyp75，為人參成分的保健食品、化妝品和藥物提供新原料稀有人參皂苷,也為其產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人參皂苷Rb1、人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品C-Mc1和C-Mc，大連三參生物科技有限公司；薄層色譜(tthin-layer chromatography，TLC)硅膠板Silica gel 60-F254，德國Merck 公司；AB-8大孔樹脂、D-280大孔樹脂，天津南開大學(xué)試劑廠;Shimadzu CS-930薄層掃描儀，日本Shimadzu公司。Waters 2695 高效液相色譜分析儀,Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower 色譜工作站，美國Waters 公司；Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，華譜創(chuàng)新科技有限公司。

T.ginsenosidimutans的bgpA基因在E.coli細(xì)胞克隆表達(dá)得到的人參皂苷酶III型的酶原體凍干粉[17-18]，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克隆酶原體的處理及酶液制備

人參皂苷酶III型基因(bgpA)在E.coli細(xì)胞表達(dá)得到200 mg人參皂苷酶III型克隆酶原體凍干品粉末,將其與14.4 g尿素、10 μL巰基乙醇和0.02 mol/L、pH 7.0的30 mL磷酸緩沖液混合，在室溫下振蕩2 h、使固體酶回復(fù)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)，再加入1.2 L(含有體積分?jǐn)?shù)5%甘油、0.5 g/L聚乙二醇、體積分?jǐn)?shù)0.003 7%巰基乙醇、0.08 g/L NaCl)0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液混合均勻，即為人參皂苷酶III型酶液，在4 ℃保存待用。

1.2.2 pH和溫度的確定

用pH為5.0、6.0、7.0、7.5和8.0的0.06 mol/L磷酸緩沖液和pH為5.0、6.0、7.0和7.5的0.06 mol/L和醋酸緩沖液，分別配制成10 g/L人參皂苷Rb1溶液，分別取0.1 mL與等體積酶液混合，37 ℃反應(yīng)3 h，分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)；取上層飽和正丁醇水層，用TLC方法檢測Rb1皂苷轉(zhuǎn)化，確定最佳pH。

用pH 7.0或7.5的0.02 mol/L的磷酸緩沖液配制成10 g/L人參皂苷Rb1溶液，取0.1 mL分別與等體積酶液混合，分別在37、45、50和65 ℃反應(yīng)6 h，再分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，取上層飽和正丁醇水層，用TLC方法檢測Rb1皂苷轉(zhuǎn)化情況，確定最佳溫度。

1.2.3 底物質(zhì)量濃度和反應(yīng)時間的確定

取0.1 mL的pH 7.0 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液分別配制成質(zhì)量濃度為10、20、50和100 g/L的底物Rb1溶液，分別與等體積酶液混合(最終Rb1質(zhì)量濃度分別為5、10、25和50 g/L)，37 ℃反應(yīng)24 h，再分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，用TLC檢測Rb1皂苷轉(zhuǎn)化情況，確定最佳底物質(zhì)量濃度。

6 g/L Rb1的0.02 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液與等體積酶液混合，在37 ℃分別反應(yīng)3、12、24、42和60 h，按不同反應(yīng)時間取0.1 mL反應(yīng)液，分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，通過TLC或高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測Rb1轉(zhuǎn)化情況，確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4 酶轉(zhuǎn)化制備稀有皂苷Gyp17和Gyp75

稀有皂苷Gyp17的制備：40 g/L人參皂苷Rb1(溶于0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液)與等體積酶液混合(最終Rb1質(zhì)量濃度為20 g/L)，37 ℃攪拌反應(yīng)24 h；經(jīng)TLC檢測，人參皂苷Rb1完全轉(zhuǎn)化為Gyp75；然后用人參皂苷Rb1質(zhì)量的25倍體積的AB-8大孔樹脂柱(固液比為1 g∶25 mL)反復(fù)吸附皂苷，用6倍柱體積的去離子水洗去糖類、蛋白等雜質(zhì)；再用6倍柱體積的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫皂苷；其洗脫液再經(jīng)AB-8大孔樹脂柱等體積的大孔離子樹脂D-280柱脫色，其D-280柱中再加少量的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫殘留的皂苷。其乙醇洗脫液通過過濾、減壓濃縮至20 mL，冷卻沉淀產(chǎn)物，過濾，沉淀物用少量冰冷的50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌，減壓干燥得產(chǎn)物皂苷Gyp17；其母液在常溫下自然揮發(fā)(經(jīng)常搖晃)沉淀產(chǎn)物，并重復(fù)多次，收集沉淀物，即得到Gyp17單體。

稀有皂苷Gyp75的制備：10 g/L人參皂苷Rb1(溶于0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液)與等體積酶液混合，37 ℃攪拌反應(yīng)60 h；然后上樣于人參皂苷Rb1質(zhì)量的25倍體積的AB-8大孔樹脂柱(固液比為1 g∶25 mL)，反復(fù)吸附皂苷，用6倍柱體積的去離子水洗去糖類、蛋白等雜質(zhì)；再用6倍柱體積的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫皂苷；其洗脫液再經(jīng)AB-8大孔樹脂柱等體積的大孔離子樹脂D-280柱脫色，其D-280柱中再加少量的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫殘留的皂苷。其乙醇洗脫液，過濾，減壓濃縮，干燥得Gyp17和Gyp75混合皂苷；其產(chǎn)物用硅膠柱法分離，得到Gyp17和Gyp75單體。

硅膠柱層析法：將分離所得Gyp17和Gyp75混合皂苷用甲醇和少量氯仿溶解，加入2.5倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠不斷攪拌，再經(jīng)水浴蒸干，即為樣品膠。裝硅膠柱，取20倍Gyp17和Gyp75混合皂苷樣品質(zhì)量的300～400目硅膠作為分離膠慢慢裝入玻璃柱內(nèi)，鋪放均勻，抽真空，上層放2～3 mm脫脂棉，其脫脂棉商標(biāo)放入上述樣品膠。其硅膠柱先用純氯仿通柱，接著用少量的氯仿與甲醇體積比分別為9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5和8∶2的洗脫液通柱。然后用氯仿、甲醇和水的體積比為7∶3∶0.1的洗脫液，逐步洗脫硅膠柱上的皂苷，每瓶收集80～150 mL，洗脫至沒有Gyp75皂苷為止，TLC檢測，分別合并Gyp17和Gyp75皂苷瓶，減壓濃縮，蒸干，分別得到Gyp17和Gyp75皂苷的白色粉末。

1.2.5 TLC方法測定人參皂苷含量

用毛細(xì)管吸取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，在TLC板上點(diǎn)樣、吹干，放入盛有展開劑的層析缸中封口展開，展開劑為氯仿-甲醇-水(體積比7∶3∶0.5)。展開結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4溶液加熱110 ℃顯色。利用Shimadzu CS-930 薄層掃描儀，掃描TLC板上的人參皂苷斑點(diǎn)，測定各人參皂苷的含量比例。

1.2.6 HPLC方法測定皂苷

流動相為乙腈-水；洗脫程序：0～20 min，20%乙腈(等梯度)；20～31 min，20%～32%乙腈(線性梯度)；31～40 min，32%～43%乙腈(線性梯度)；40～70 min，43%～100%乙腈(線性梯度)；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃；體積流量0.6 mL/min；檢測波長203 nm；柱效78 000 塔板/m。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷酶III型與人參皂苷Rb1的反應(yīng)

為了解T.ginsenosidimutans人參皂苷酶III型基因(bgpA)在E.coli細(xì)胞表達(dá)得到的轉(zhuǎn)基因人參皂苷酶III型與人參皂苷Rb1的反應(yīng)產(chǎn)物，取0.2 mL 20 g/L的Rb1溶液與等體積的該酶混合(最終Rb1質(zhì)量濃度為10 g/L)，準(zhǔn)備3份，37 ℃分別反應(yīng)6、16和48 h；分別加入0.4 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，離心，分別取0.1 mL正丁醇層，吹干，分別溶解于1 mL甲醇中，用HPLC方法測定反應(yīng)液中的皂苷，如圖1-a所示。

由圖1-a可知，10 g/L的人參皂苷Rb1酶反應(yīng)6 h，40%以上的Rb1轉(zhuǎn)化為Gyp17；反應(yīng)16 h，大部分Rb1轉(zhuǎn)化為Gyp17和Gyp75皂苷；當(dāng)反應(yīng)40 h時，Rb1皂苷全部水解成Gyp17和Gyp75皂苷，說明該人參皂苷酶III型的反應(yīng)過程為：先水解人參皂苷Rb1的3-O-末端D-葡萄糖基生成稀有皂苷Gyp17；進(jìn)一步水解Gyp17的3-O-D-葡萄糖基生成稀有皂苷Gyp75，如圖1-b所示。

a-不同酶反應(yīng)時間人參皂苷Rb1的酶解產(chǎn)物的HPLC圖;b-人參皂苷酶III型水解Rb1反應(yīng)式圖1 人參皂苷酶III型水解Rb1的反應(yīng)Fig.1 Ginsenoside Rb1 hydrolysis by cloning ginsenosidase type-III注：1-Rb1反應(yīng)6 h的酶解產(chǎn)物；2-Rb1反應(yīng)16 h的酶解產(chǎn)物；3-Rb1反應(yīng)40 h的酶解產(chǎn)物

2.2 pH和溫度對酶反應(yīng)的影響

用pH 5.0、6.0、7.0、7.5和8.0的0.05 mol/L磷酸緩沖液，pH 5.0、6.0、7.0和7.5的0.05 mol/L醋酸緩沖液，分別配制成10 g/L人參皂苷Rb1溶液，取0.1 mL分別與等體積酶液混合，37 ℃反應(yīng)12 h后，分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，取上層飽和正丁醇水層用TLC檢測，結(jié)果如圖2所示。展開劑:氯仿、甲醇和水體積比為7∶3∶0.5，以體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4溶液為顯色劑在110 ℃顯色。

Rb1、Gyp17、Gyp75、C-K和Rh2，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；1～5，分別為pH7.5、7.0、5.0、6.0和8.0的磷酸緩沖液反應(yīng)產(chǎn)物；6～9，分別為pH 5.0、6.0、7.0和7.5的醋酸緩沖液反應(yīng)產(chǎn)物圖2 不同pH緩沖液對Rb1酶反應(yīng)影響的TLC圖Fig.2 Different pH effects on Rb1 enzyme reaction by TLC

由圖2可知，該酶轉(zhuǎn)化Rb1皂苷只有在pH 7.0和7.5的磷酸緩沖液中反應(yīng)；而在pH 5.0、6.0和8.0的磷酸緩沖液或pH 5.0、6.0、7.0和7.5的醋酸緩沖液中，該酶幾乎不水解人參皂苷Rb1。因此，該酶水解Rb1 的最佳pH為7.0和7.5的磷酸緩沖液。

溫度的影響：用pH 7.0或7.5的0.02 mol/L的磷酸緩沖液配制成10 g/L人參皂苷Rb1溶液，其0.1 mL分別與等體積酶液混合，在37、45、50和65 ℃分別反應(yīng)6 h，分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，取上層飽和正丁醇水層用TLC檢測，結(jié)果如圖3所示。展開劑:氯仿、甲醇和水體積比為7∶3∶0.5，以體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4溶液為顯色劑在110 ℃顯色。

由圖3可知，該酶在37和45 ℃時，水解Rb1皂苷較好；在50和60 ℃時Rb1的水解反應(yīng)較差，因此，其最佳反應(yīng)溫度為37和45 ℃。

Rb1、Gyp17、Gyp75、C-K和Rh2，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；5 g/L Rb1在pH 7.0、不同溫度下分別反應(yīng)6 h：1-37 ℃反應(yīng)產(chǎn)物；2-45 ℃反應(yīng)產(chǎn)物；3-反應(yīng)50 ℃反應(yīng)產(chǎn)物；4-60 ℃反應(yīng)產(chǎn)物圖3 不同溫度對Rb1酶反應(yīng)影響的TLC圖Fig.3 Enzymatic reaction in different temperature by TLC

總之，通過E.coli克隆表達(dá)的人參皂苷酶III型水解Rb1皂苷的最佳溫度為37和45 ℃，最佳pH為7.0和7.5的磷酸緩沖液。

2.3 底物質(zhì)量濃度與時間對酶反應(yīng)的影響

底物濃度對酶反應(yīng)的影響：分別取0.1 mL的10、20、50和100 g/L的底物Rb1的pH 7.0、0.02 mol/L磷鹽緩沖液與等體積酶液混合(最終Rb1質(zhì)量濃度為5、10、25和50 g/L)，37 ℃反應(yīng)24 h，再分別加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，取上層飽和正丁醇水層用TLC檢測，結(jié)果如圖4所示。展開劑:氯仿、甲醇和水體積比為7∶3∶0.5，以體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4溶液在110 ℃顯色。

Rb1、Gyp17、Gyp75、C-K和Rh2，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；不同濃度的Rb1與酶液在37 ℃下反應(yīng)24 h的產(chǎn)物：1-50 g/LRb1的反應(yīng)產(chǎn)物；2-10 g/L Rb1的反應(yīng)產(chǎn)物；3-25 g/L Rb1的反應(yīng)產(chǎn)物；4-50 g/L Rb1的反應(yīng)產(chǎn)物圖4 不同Rb1底物質(zhì)量濃度對酶反應(yīng)影響TLC圖Fig.4 Effect of Rb1 concentration on enzymatic reaction by TLC

由圖4可知，5 g/L的Rb1皂苷酶反應(yīng)24 h，Rb1幾乎全部轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Gyp17 和Gyp75；10和25 g/L的Rb1皂苷酶反應(yīng)24 h，Rb1幾乎全部轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Gyp17；50 g/L的Rb1皂苷酶反應(yīng)24 h，部分Rb1皂苷轉(zhuǎn)化為Gyp17。因此，從Rb1皂苷制備Gyp17，10和25 g/L的Rb1皂苷，酶反應(yīng)24 h即可；要制備Gyp75皂苷，5 g/L的Rb1皂苷，酶轉(zhuǎn)化時間需超過24 h。

反應(yīng)時間對酶反應(yīng)的影響：6 g/L Rb1的0.02 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液與同體積酶液混合(最終Rb1質(zhì)量濃度為3 g/L)，在37 ℃下分別反應(yīng)3、12、24、42和60 h，按不同時間分別取0.1 mL反應(yīng)液，加入0.2 mL飽和正丁醇水溶液終止反應(yīng)，取上層飽和正丁醇水層用TLC檢測，結(jié)果如圖5所示。展開劑:氯仿、甲醇和水體積比為7∶3∶0.5，以體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4為顯色劑溶液在110 ℃顯色。

Rb1、Gyp17、Gyp75、C-K和Rh2，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品;1-Rb1反應(yīng)3 h酶反應(yīng)產(chǎn)物；2-12 h酶反應(yīng)產(chǎn)物；3-24 h酶反應(yīng)產(chǎn)物；4-42 h酶反應(yīng)產(chǎn)物；5-60 h酶反應(yīng)產(chǎn)物圖5 反應(yīng)時間對Rb1皂苷酶反應(yīng)的影響TLC圖Fig.5 Reaction time effect on ginsenoside Rb1 enzyme reaction by TLC

由圖5可知，3 g/L的Rb1酶反應(yīng)3和6 h，部分Rb1水解成Gyp17；反應(yīng)24 h，Rb1幾乎全部反應(yīng)成Gyp17和少量的Gyp75；反應(yīng)42 h，逐漸增加產(chǎn)物Gyp75；反應(yīng)60 h，主要產(chǎn)物為Gyp75。

根據(jù)上述結(jié)果，以Rb1酶轉(zhuǎn)化制備Gyp17，10和25 g/L的Rb1 37 ℃酶反應(yīng)24 h為最佳條件；要從Rb1酶轉(zhuǎn)化制備Gyp75，5 g/L的Rb1 37 ℃酶反應(yīng)時間超過40 h。按此條件，制備如下Gyp17和Gyp75單體皂苷。

2.4 酶轉(zhuǎn)化制備Gyp17和Gyp75

Gyp17皂苷的制備：在250 mL三角瓶中加入4 g Rb1(3.6 mmol/L)和100 mL 0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鈉鹽緩沖液混合，再加入100 mL酶液混和均勻(最終Rb1質(zhì)量濃度為20 g/L)，封口，37 ℃搖床反應(yīng)24 h，經(jīng)TLC檢測，人參皂苷Rb1完全轉(zhuǎn)化為Gyp75；然后在直徑30 mm的150 mL 大孔樹脂AB-8柱上反復(fù)吸附皂苷，用900 mL去離子水洗去糖類、蛋白等雜質(zhì)；用900 mL的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫AB-8，經(jīng)TLC檢測無皂苷為止；其洗脫液再經(jīng)直徑30 mm的150 mL 大孔離子樹脂D-280柱脫色，其D-280柱中再加200 mL的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫殘留的皂苷；其乙醇洗脫液，過濾、減壓濃縮至20 mL，冷卻沉淀產(chǎn)物，過濾，沉淀物用少量冰冷的50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗凍，減壓干燥得產(chǎn)物皂苷Gyp17；其母液在常溫下自然揮發(fā)(經(jīng)常搖晃)沉淀產(chǎn)物，重復(fù)幾次收集沉淀干燥得Gyp17；共得到3.1 g稀有皂苷Gyp17(3.27 mmol/L)單體。與標(biāo)準(zhǔn)品Gyp17皂苷相比，經(jīng)HPLC檢測(圖6)，所得到Gyp17皂苷單體純度超過90%；Gyp17理論的摩爾得率為90.8%。

圖6 由Rb1酶轉(zhuǎn)化制備的稀有皂苷Gyp17和Gyp75單體HPLC圖Fig.6 The HPLC of ginsenoside Gyp17 and Gyp75 from Rb1 by enzyme reaction

Gyp75皂苷的制備：取4 g Rb1(3.6 mmol/L)溶于400 mL 0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鈉鹽緩沖液中，分成4份放入250 mL三角瓶中，分別加入100 mL酶液(最終Rb1質(zhì)量濃度為50 g/L)，封口，在37 ℃搖床反應(yīng)60 h，合并反應(yīng)液，經(jīng)TLC和HPLC檢測，反應(yīng)產(chǎn)物中Gyp17和Gyp75峰面積比為19∶81。合并的反應(yīng)液，在直徑30 mm的150 mL 大孔樹脂AB-8柱上反復(fù)吸附皂苷，用900 mL去離子水洗去糖類、蛋白等雜質(zhì)；用900 mL的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫AB-8，經(jīng)TLC檢測無皂苷為止；其洗脫液再經(jīng)直徑30 mm的150 mL大孔離子樹脂D-280柱脫色，其D-280柱中再加200 mL的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫殘留的皂苷；其乙醇洗脫液，過濾、減壓濃縮、干燥得2.7 g Gyp17和Gyp75混合皂苷；其產(chǎn)物用硅膠柱法分離的Gyp17得Gyp75單體。

將所得的2.7 g混合皂苷產(chǎn)物，用甲醇和少量氯仿溶解，加入6.5 g 80～100目硅膠，在水浴中攪拌干燥得樣品膠，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的60 g 300～400目硅膠柱的上部，用純氯仿、含少量甲醇的氯仿通開硅膠柱，然后用氯仿∶甲醇∶水體積比為7∶3∶0.1的洗脫液洗脫硅膠柱上所吸附的皂苷，每瓶收集80 mL洗脫液，一直洗脫完Gyp75。所收集的洗脫液瓶經(jīng)TLC檢測，分別合并Gyp75洗脫液瓶和Gyp17洗脫液，濃縮，蒸干，分別得到2.1 g Gyp75單體(2.67 mmol/L)和0.45 g Gyp17單體(0.47 mmol/L)；經(jīng)HPLC檢測(圖6)，所得到Gyp75和Gyp17皂苷單體純度均為90%；Gyp75的Gyp17的摩爾得率分別為74.2%和13.1%。由此，由低活性人參皂苷Rb1成功地制備了人參稀有皂苷Gyp17和Gyp75單體。

3 結(jié)論

T.ginsenosidimutans的bgpA基因，在E.coli細(xì)胞表達(dá)得到的人參皂苷酶III型，能水解人參皂苷Rb1的3-O-末端D-葡萄糖基生成稀有皂苷Gyp17；進(jìn)一步水解Gyp17的3-O-D-葡萄糖基生成稀有皂苷Gyp75。該酶水解Rb1皂苷最佳溫度為37和45 ℃，最佳pH為7.0和7.5的磷酸緩沖液。從Rb1酶轉(zhuǎn)化制備Gyp17的最佳反應(yīng)條件是在10和25 g/L Rb1皂苷的pH 7.0和7.5的磷酸緩沖液中37 ℃酶反應(yīng)24 h；若要制備Gyp75，5 g/L Rb1在37 ℃酶反應(yīng)時間超過40 h。

將20 g/L 的人參皂苷Rb1在37 ℃酶應(yīng)24 h，從4 g Rb1制備了3.1 g稀有皂苷Gyp17，其摩爾得率為90.8%。將5 g/L的人參皂苷Rb1 37 ℃酶反應(yīng)60 h，從4 g Rb1制備了2.1 g的Gyp75和Gyp17單體和0.45 g的Gyp17單體；Gyp75的摩爾得率分別為74.2%和13.1%。

由此，利用轉(zhuǎn)基因人參皂苷酶III型，從人參皂苷Rb1成功地制備了稀有皂苷Gyp75和Gyp17單體，為其產(chǎn)業(yè)化提供了依據(jù)。