肖勝艦，郭浩，黃鈞，周榮清,3，張立強(qiáng)，金垚*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065) 2(四川大學(xué) 制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610065) 3(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州，646000) 4(瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州，646000)5(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)

雪梨具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)心臟、降低血壓等多重功效[1]，但其存在不耐儲(chǔ)藏、附加值低等問題，利用發(fā)酵工藝對(duì)雪梨進(jìn)行深加工，不僅能解決這些問題，還能豐富果酒種類，滿足人們對(duì)于營養(yǎng)保健食品不斷增加的需求。梨酒風(fēng)味獨(dú)特，清新淡雅，帶有梨的特征香氣，酒體顏色晶瑩剔透，營養(yǎng)豐富。

目前，國內(nèi)外研究者對(duì)特定種類的果酒進(jìn)行了大量的研究，如葡萄酒[2-3]、蘋果酒[4-5]、桑葚酒[6-8]等，但針對(duì)梨酒的研究較少，且主要集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化[9-10]及菌種篩選[11]等方面，而針對(duì)雪梨酒的研究主要集中在復(fù)配發(fā)酵底物來豐富雪梨酒的類型[12-14]。初步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵周期對(duì)梨酒口感有重要的影響，且發(fā)酵周期短的甜型梨酒口感更好，因此，研究梨酒的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律對(duì)于優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要的意義，而相關(guān)研究目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)甜型梨酒發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)(總糖、總酸、酒精度、干浸出物等)和揮發(fā)性組分進(jìn)行了動(dòng)態(tài)跟蹤分析，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，獲得梨酒品質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。本研究結(jié)果對(duì)梨酒發(fā)酵過程的工藝優(yōu)化與控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：河北趙縣雪花梨。

試劑：葡萄酒果酒專用酵母(SY)，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；NaCl、NaOH、NaHSO3，成都科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸、次甲基藍(lán)、葡萄糖、(NH4)2SO4、CuSO4、酒石酸鉀鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司；果膠酶制劑(LALLZYME EX- )，法國拉曼公司；其他未說明試劑均采購自阿拉丁。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-E19原汁機(jī)，九陽股份有限公司；CeraMem-0025陶瓷膜小試設(shè)備(配備0.45 μm陶瓷膜)，廈門福美科技有限公司；CS501超級(jí)恒溫水浴鍋，上海浦東榮豐科技儀器有限公司；BS100S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CX31顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；FEB-85恒溫磁力攪拌器，上海雙捷有限公司；DZS-708多參數(shù)分析儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；IR200型手持式折光儀，上海儀邁儀器科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雪梨酒的制備

工藝流程：河北雪梨→洗凈榨汁(加SO2)→酶解→添加營養(yǎng)物→接種酵母→(20±1)℃發(fā)酵→倒罐/微濾→雪梨酒。

基本操作步驟：選擇成熟度較為一致，健康無病斑的新鮮雪梨，去梗流水沖洗干凈，帶皮切塊榨汁，添加70 mg/L SO2殺菌并防止氧化，加入40 mg/L果膠酶制劑提高果實(shí)出汁率，室溫酶解24 h。根據(jù)目標(biāo)酒精度添加所需白砂糖，以200 mg/L的接種量接種酵母，啟動(dòng)發(fā)酵，溫度控制在(20±1) ℃。發(fā)酵結(jié)束后，使用陶瓷膜過濾不同發(fā)酵時(shí)間醪液除菌中止發(fā)酵，即可得發(fā)酵各階段雪梨酒。

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

總糖(斐林試劑直接滴定法)、總酸(電位滴定法)、干浸出物(密度瓶法)、和酒精度(酒精計(jì)法)測(cè)定方法依據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH值由pH計(jì)測(cè)定；可溶性固形物由手持式折光儀測(cè)定；酵母菌數(shù)由顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.3 揮發(fā)性組分的測(cè)定

參考XIONG等[15]、GOU等[16]及NIU等[17]的方法。準(zhǔn)確量取1.00 mL梨酒樣品于裝有磁力攪拌棒的25 mL頂空瓶中，加入1.00 mL蒸餾水及過量的NaCl使溶液飽和，以促進(jìn)揮發(fā)性組分的揮發(fā)。加入10 μL辛酸甲酯(0.007 6 g/100 mL)和2-辛醇(0.007 1 g/100 mL)混合溶液。將頂空瓶置于60 ℃水浴中，預(yù)平衡15 min；插入固相萃取針，并將微萃取頭(D B/CAR/PDMS，50/30 μm)伸出暴露于頂空瓶上空，于60 ℃吸附萃取45 min。

GC-MS配備條件：Thermo Fisher Electron公司出品的Trace GC Ultra DSQ II氣相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜儀配備HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱，對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行分離與檢測(cè)。

分離條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃;以高純氦氣為載氣，流速設(shè)為1.00 mL/min，以分流模式進(jìn)行，分流比為10∶1;色譜柱溫度以程序性進(jìn)行升溫,40 ℃為起始柱溫，在此溫度下維持5 min，然后以5 ℃/min升溫至220 ℃并維持5 min。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子強(qiáng)度70 e ，離子源和轉(zhuǎn)換線溫度分別為200和250 ℃。色譜掃描范圍m/z為40～400 amu。

1.4 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)小組由15名年齡在20～30歲的學(xué)生組成。由專業(yè)的果酒品評(píng)師按照GUCHU等[18]的方法進(jìn)行訓(xùn)練。在無異味、安靜、光線充足、25 ℃、相對(duì)濕度45%～55%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行品評(píng)。將待測(cè)樣品撕去標(biāo)簽，隨機(jī)擺放，將酒樣均勻倒入國際標(biāo)準(zhǔn)化品嘗杯中，每個(gè)樣品的體積為30 mL。邀請(qǐng)?jiān)u測(cè)人員通過眼、鼻、口等對(duì)發(fā)酵梨酒進(jìn)行感官分析，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)梨酒色澤、甜香、果香、酸香、風(fēng)格、口味6項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行打分評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)按0(差)到10(好)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。最后，通過繪制雷達(dá)圖給出評(píng)價(jià)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示(n=3)。采用Origin 9.0為作圖軟件,使用SPSS 21.0軟件單因素方差分析(One-way ANO A)中的Duncan’s 功能進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),使用simca 14.1對(duì)風(fēng)味進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中梨酒酵母數(shù)和理化指標(biāo)的變化

果酒發(fā)酵過程中的酵母生長(zhǎng)曲線如圖1所示。發(fā)酵1 d時(shí)酵母數(shù)為3.95×106CFU/mL，隨發(fā)酵過程的進(jìn)行酵母數(shù)不斷上升，在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到3.23×107CFU/mL。發(fā)酵初期營養(yǎng)物質(zhì)充分，酵母繁殖速率旺盛，酵母數(shù)量迅速上升。隨后在發(fā)酵達(dá)到中后期時(shí)，底物被消耗，酵母的代謝和繁殖速度下降，酵母增長(zhǎng)變緩。

圖1 發(fā)酵過程中梨酒酵母菌數(shù)和主要理化指標(biāo)的變化Fig.1 E olution of yeast count and main physicochemical indexes of pear wine during fermentation

由圖1可知，在梨酒發(fā)酵1 d時(shí)，酵母大量繁殖產(chǎn)生少量酒精，發(fā)酵1 d后酵母消耗糖類產(chǎn)生酒精。發(fā)酵2 d時(shí)酒精度達(dá)到5.4% ol，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總糖減少速率趨于平緩。發(fā)酵第5天，酒精度和總糖水平趨于穩(wěn)定，此時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)濃度的降低及高濃度的酒精抑制了酵母代謝。發(fā)酵第6天時(shí)，總糖質(zhì)量濃度為29.34 g/L，而酒精度已達(dá)到13.1% ol，終止發(fā)酵。同時(shí)，隨發(fā)酵的進(jìn)行，可溶性固形物(total soluble solid,TSS)含量逐漸降低，這與發(fā)酵過程中總糖的變化一致；進(jìn)入發(fā)酵中后期，梨酒的TSS含量逐漸趨于穩(wěn)定。干浸出物是果酒非揮發(fā)性物質(zhì)的總和，包括游離酸及鹽類、單寧、色素、果膠、礦物質(zhì)等，其含量決定著果酒的主體風(fēng)味，干浸出物含量較高則酒體醇厚豐潤，相反，則酒體單薄寡淡[19]。在梨酒的發(fā)酵過程中，干浸出物含量不斷升高，第2天至第3天增長(zhǎng)速率最大，可能是由于發(fā)酵前期營養(yǎng)物充分，酵母代謝旺盛，酵母將營養(yǎng)物代謝為多種物質(zhì)，通過干浸出物得以表征，故而其含量大幅上升。進(jìn)入發(fā)酵后期，糖類物質(zhì)減少，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)干浸出物達(dá)到最大值為35.66 g/L。

總酸是果酒發(fā)酵中的重要理化指標(biāo)，對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)、成品酒的酒體和風(fēng)味起著重要作用[20]。由圖1可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母代謝旺盛，將糖類物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化為酸類等物質(zhì)，總酸增加，但是增加幅度在逐步減少，在第5天到第6天趨于穩(wěn)定(增幅0.08 g/L)。雪梨汁在補(bǔ)加糖及營養(yǎng)劑后接種發(fā)酵，pH顯著下降至3.01。整個(gè)發(fā)酵過程pH是趨于穩(wěn)定但有小幅度波動(dòng)。酵母在發(fā)酵前期主要為有氧呼吸，繁殖迅速，代謝產(chǎn)生了一系列有機(jī)酸導(dǎo)致pH降低，而并未通過無氧呼吸生成大量酒精及CO2[21]發(fā)酵中后期，酵母主要進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生的醇類和酸類因酯化消耗，pH基本穩(wěn)定。

2.2 發(fā)酵過程中梨酒揮發(fā)性組分的變化

揮發(fā)性成分是構(gòu)成和影響果酒品質(zhì)及典型性的主要因素之一, 也是衡量果酒質(zhì)量的重要指標(biāo)[22]。通過頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)梨酒不同發(fā)酵階段的酒樣進(jìn)行揮發(fā)性組分鑒定，共檢出揮發(fā)性組分34種，其中酯類12種，醇類物質(zhì)7種，醛酮類物質(zhì)4種，酸類4種，酚類3種，其他4種，各類物質(zhì)的總量及所占比例如圖2所示(詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1)。

梨酒揮發(fā)性組分的含量隨發(fā)酵時(shí)間不斷升高(圖2-a)。揮發(fā)性物質(zhì)總量在第5天和第6天增加顯著，主要體現(xiàn)在醇類、酸類及酯類物質(zhì)的增加。相比第3天，發(fā)酵第4天的揮發(fā)性物質(zhì)總量變化較少。

醇類物質(zhì)是果酒中主要的香氣組分，由原料中的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類在發(fā)酵過程中產(chǎn)生，香氣主要表現(xiàn)為甜香、花果香[23]。本研究共檢出7種醇類，分別為異丁醇、異戊醇、正己醇、順-3-己烯-1-醇、芳樟醇、α-松油醇、苯乙醇。酒樣中含量最高的為異戊醇、其次是苯乙醇，它們共同貢獻(xiàn)梨酒香氣中的茉莉花香、玫瑰香和果香[24]，占醇類物質(zhì)總量的92%以上，是構(gòu)成梨酒的醇類風(fēng)味主要物質(zhì)。

a-發(fā)揮性組分質(zhì)量濃度;b-各組分占比圖2 發(fā)酵過程中梨酒揮發(fā)性組分的變化趨勢(shì)Fig.2 E olution of olatile components in pear wine during fermentation

果酒中的酸類物質(zhì)是由發(fā)酵初期酵母細(xì)胞繁殖代謝以及中后期醇類物質(zhì)氧化產(chǎn)生的[25]。酸類物質(zhì)不僅參與酯的形成過程，且對(duì)果酒的香氣有著不可忽視的調(diào)節(jié)和平衡作用[26]。實(shí)驗(yàn)共檢出酸類組分4種：己酸、辛酸、正癸酸、(±)-3-羥基月桂酸。梨酒發(fā)酵前期，酵母細(xì)胞繁殖較快，代謝產(chǎn)酸，發(fā)酵過程中部分積累的酸與糖代謝產(chǎn)生的醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，發(fā)酵后期各類香氣組分大量積累，部分酸依然作為中間產(chǎn)物向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化。其中，辛酸是梨酒中含量較高的有機(jī)酸，低濃度時(shí)具有水果香、花香味，但是高濃度時(shí)具有油脂腐敗味和澀味[27]，該酸含量在發(fā)酵第4天時(shí)最低，而發(fā)酵第5、6天有較大程度的升高，可能對(duì)果酒風(fēng)味有不利影響。

表1 梨酒樣品中揮發(fā)性組分含量(n=3) 單位：μg/L

續(xù)表1

酯類物質(zhì)是酵母代謝產(chǎn)生的醇與積累的酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成的[28]，是梨酒香氣組分中最為重要的種類之一，大多數(shù)酯類具有特別的花果香氣，對(duì)成品梨酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[29]。本研究共檢出12種酯類，含量最多的3種分別是乙酸異戊酯、辛酸乙酯和正己酸乙酯，呈現(xiàn)出梨子香、甜香、水果香和水果糖香[27]，以及癸酸乙酯(梨和白蘭地香[30])、乙酸苯乙酯(愉悅的花香[31])和其他7種脂類物質(zhì)。由圖2-a可知，酯類物質(zhì)含量隨發(fā)酵的進(jìn)行有顯著增加，在第5天含量達(dá)到最高,隨后略有下降。

如表1所示，酚類物質(zhì)含量略有變化，活性物質(zhì)4-乙基-愈創(chuàng)木酚只在第3、4天檢出，而4-乙烯-愈創(chuàng)木酚基本無變化。醛酮類和其他類物質(zhì)類似，只有小范圍波動(dòng)。

梨酒發(fā)酵過程中，揮發(fā)性組分的含量總體增長(zhǎng)，而各類組分的增長(zhǎng)率有差異，因此，各組分占比有較大變化，以酯類、醇類和酸類的變化最為明顯(圖2-b)。發(fā)酵第4天，酯類物質(zhì)比例增加，酸類占比降低，發(fā)酵梨酒被賦予更多的花香和果香，風(fēng)味開始凸顯。發(fā)酵第5天，酯類和酸類組分繼續(xù)富集，導(dǎo)致醇類組分的占比下降，酯-醇-酸的比例達(dá)到一定程度的平衡，酒體較為協(xié)調(diào)。發(fā)酵第6天，醇類組分含量增長(zhǎng)顯著，其占比較第5天有較大程度提高，并壓縮了酯類和酸類組分的占比，影響了酒體的協(xié)調(diào)性。

2.3 基于風(fēng)味物質(zhì)的梨酒PCA

為了更好的分析發(fā)酵階段對(duì)梨酒風(fēng)味物質(zhì)的影響，對(duì)4個(gè)發(fā)酵時(shí)間的梨酒樣品及檢測(cè)到的34個(gè)風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行主成分分析。以第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)建模作載荷、得分雙標(biāo)圖如圖3所示。其中PC1和PC2累積貢獻(xiàn)率為85.80%，模型可靠。由圖3可知，發(fā)酵第3、4、5和6天的酒樣分別在4個(gè)象限，風(fēng)味差距明顯。由圖3-a可知，棕櫚酸乙酯(10)、甘油亞麻酸酯(12)、4-乙基-愈創(chuàng)木酚(26)和對(duì)甲基苯甲醛(27)是發(fā)酵第3天酒樣的特征組分；發(fā)酵第4天，各類組分大量轉(zhuǎn)化；在發(fā)酵第5天的梨酒中，酯類構(gòu)成了其主要特征組分；發(fā)酵第6天則是醇類和酸類為主要成分。氣味活度值(odor acti ity alue,OA )聚類結(jié)果(圖3-b)則表明，第5天有3種特征物質(zhì)OA >1、4種特征物質(zhì)1>OA ≥0.1，風(fēng)味特征明顯。而第6天的特征物質(zhì)僅芳樟醇OA >1，其余3種物質(zhì)OA 均為0.1～1。

a-風(fēng)味組分;b-OA圖3 基于風(fēng)味物質(zhì)的梨酒主成分分析圖Fig.3 Principal components analysis based on the olatiles in different pear wine注:3rd、4th、5th、6th為發(fā)酵時(shí)間(d);1～34為化合物序號(hào)(同表1)

根據(jù)PCA結(jié)果，可作如下推測(cè)：發(fā)酵第5天的梨酒中由于以酯類物質(zhì)為主的特征組分豐富，且富集了絕大多數(shù)梨酒中OA >1的香氣組分，因而具有更豐富的果香，且更具典型性。為了驗(yàn)證此推測(cè)，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的酒樣進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)。

2.4 感官評(píng)價(jià)

a-感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖;b-感官評(píng)價(jià)總分圖4 梨酒樣品的感官評(píng)價(jià)得分。Fig.4 Sensory e aluation scores of pear wine samples

不同發(fā)酵階段梨酒的感官分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。在梨酒發(fā)酵過程中，糖、酸、風(fēng)味組分等物質(zhì)時(shí)刻發(fā)生變化，因此，發(fā)酵程度對(duì)梨酒品質(zhì)的影響顯著。發(fā)酵第3天，梨酒甜味突出，具有豐富果香味，但酸香和甜香不足，是因?yàn)槔婢频奶卣黠L(fēng)味組分尚未全部生成，在典型性方面欠缺。因此，在此發(fā)酵階段的梨酒風(fēng)味寡淡，酒香不突出。發(fā)酵第4天，總糖含量仍然較高，甜度酸度較為協(xié)調(diào)，酒體相比第3天獲得了一定的風(fēng)味層次感，但果香減弱，風(fēng)格并不突出。發(fā)酵第5天，總糖含量降低，甜香和酸香均得以體現(xiàn)，酸甜協(xié)調(diào)、果香濃郁、有層次感，在此發(fā)酵階段酒樣獲得了較為典型的甜型梨酒風(fēng)格。發(fā)酵第6天時(shí)，醇香濃郁、果香味寡淡、酸味突出、略帶澀味，感官評(píng)價(jià)得分較第5天有所降低，這可能與其酯類占比下降、醇類占比反彈有一定的關(guān)系，可見揮發(fā)性組分總量的增高并不一定提升梨酒的整體風(fēng)格。在酒體色澤方面，發(fā)酵第3天呈淺黃色，第4～6天的樣品酒體均呈現(xiàn)優(yōu)雅的金黃色，未表現(xiàn)出顯著差異。

發(fā)酵第3～6天梨酒樣品的感官評(píng)價(jià)表明，隨著梨酒發(fā)酵的進(jìn)行，酒精度升高的同時(shí)果香味也隨之變淡，果香和酸香在發(fā)酵的第5天達(dá)到比較平衡的狀態(tài)，此酒樣在感官評(píng)價(jià)中的得分最高，結(jié)合梨酒理化指標(biāo)及揮發(fā)性組分的分析，建議發(fā)酵5 d為雪梨酒的最佳發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和揮發(fā)性組分等進(jìn)行跟蹤分析，揭示了甜型梨酒品質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。結(jié)果表明,酒精度、總糖、總酸、干浸出物等理化指標(biāo)和揮發(fā)性組分，對(duì)發(fā)酵梨酒品質(zhì)的影響顯著。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糖不斷消耗，酒精度、干浸出物不斷升高，揮發(fā)性組分及其含量也不斷增加,而比例則不斷變化。相比之下,發(fā)酵第5天的梨酒具有更加協(xié)調(diào)的品質(zhì)，如繼續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致酯類組分比例的降低和醇類組分比例的升高，從而影響梨酒口感，因此，對(duì)于雪花梨，梨酒的最佳發(fā)酵飲用時(shí)間建議為第5天。