張麗杰，張懷志，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

醬油是以黃豆(豆粕)和面粉(烤小麥)為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵形成的香氣濃郁、富含營養(yǎng)的一類基礎(chǔ)調(diào)味品，被廣泛用于亞洲人民的食物烹飪[1-3]。吡嗪是一類在1,4位含氮的六元雜環(huán)化合物，通常以極低的閾值呈現(xiàn)焙烤、堅果香氣，是醬油中一類重要的風(fēng)味化合物[4-6]。目前為止，在醬油中被檢測出的吡嗪化合物有47種，其中，有14種吡嗪在醬油中被認(rèn)定為有香氣貢獻(xiàn)，占吡嗪種類的30%[7]。我國醬油制作工藝及香氣獨特，研究者在我國醬油中共發(fā)現(xiàn)了12種具有風(fēng)味貢獻(xiàn)的吡嗪化合物，分別為2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine, 2,5-DMP)、2,6-二甲基吡嗪(2,6-dimethylpyrazine, 2,6-DMP)、2,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5-trimethylpyrazine, 2,3,5-TMP)、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(2-ethyl-3,5-dimethylpyrazine, 3,5-EDMP)、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪(2-ethyl-3,6-dimethylpyrazine, 3,6-EDMP)、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-異戊基-6-甲基吡嗪、2-異戊基-3,6-二甲基吡嗪、2-乙烯基吡嗪及2-乙烯基-6-甲基吡嗪[1, 8-10](圖1)。除風(fēng)味貢獻(xiàn)，一些吡嗪化合物還被證明具有健康及藥用價值[11-12]。在醬油品質(zhì)提升計劃中，如何理性提高醬油中吡嗪化合物的種類及濃度一直是研究者面對的共性問題。

圖1 中國醬油中具有風(fēng)味貢獻(xiàn)的吡嗪化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Fla or contribution pyrazines in Chinese soy sauce注：方框圈出的吡嗪為本研究通過發(fā)酵劑及底物添加實現(xiàn)質(zhì)量濃度提升的吡嗪化合物

吡嗪化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且合成途徑多樣，目前僅有少數(shù)吡嗪化合物合成途徑得到解析[4]。2010年，JEROEN等[13-14]通過基因敲出手段，推測出2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine, 2,3,5,6-TTMP)的微生物合成途徑。2019～2020年，本課題組通過微生物篩選、基因敲除與回補、多組合同位素示蹤等技術(shù)，相繼解析出了2,5-DMP、2,3,5-TMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP的微生物合成機制[15-16]。通過對已解析的吡嗪微生物合成機制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)如上烷基吡嗪的合成微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，合成底物為廉價可得的L-蘇氨酸和/或D-葡萄糖?？莶菅挎邨U菌為生物安全菌株, 且天然存在于醬油發(fā)酵體系[2, 17]。因此，將高產(chǎn)吡嗪的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑加入到醬油發(fā)酵體系，并合理添加發(fā)酵底物，將有潛力實現(xiàn)醬油中吡嗪種類及濃度的有效提升。

本研究前期篩選得到了1株來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的、可合成7種烷基吡嗪的枯草芽孢桿菌。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建模擬醬油發(fā)酵體系，分析加入發(fā)酵劑及發(fā)酵底物L(fēng)-蘇氨酸及D-葡萄糖對吡嗪化合物種類及含量的影響。在模擬醬油發(fā)酵體系中，同時加入高產(chǎn)吡嗪的B.subtilisNr.5及發(fā)酵底物，可有效促進(jìn)醬油中吡嗪化合物種類及濃度的提升。本研究有助于解析醬油發(fā)酵體系中烷基吡嗪的來源，首次為醬油中吡嗪化合物的高效合成提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

理化試劑：L-蘇氨酸、D-葡萄糖、鹽酸、NaCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉(OXID)、蛋白胨(OXID)，江蘇博美達(dá)試劑公司；磺基水楊酸、乙腈、甲酸，上海Thermo Fisher試劑公司；2,3,5-TMP、2,3,5,6-TTMP、3,5-EDMP、3,6-EDMP、2,3-二甲基吡嗪(2,3-dimethylpyrazine, 2,3-DMP)、2,5-DMP、2,6-DMP、2-甲基-3-甲硫基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，Sigma-Aldrich公司。

B.subtilisNr.5為實驗室前期篩選及保藏菌株[16]。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨 10、NaCl 10;若固體培養(yǎng)基則另加入瓊脂 20 g、pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

YPDM液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10、蛋白胨 10，pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌30 min。

Y-G培養(yǎng)基：酵母粉11.11 g、蛋白胨 11.11 g、蒸餾水 1 L，pH 7.2～7.4，分裝45 mL至250 mL三角瓶中，115 ℃滅菌30 min。配制母液質(zhì)量濃度為50 g/L的D-葡萄糖，無菌條件下采用0.22 μm水系濾頭過濾后，按5 mL的量進(jìn)行添加，使D-葡萄糖的終質(zhì)量濃度為5 g/L。

Y-T培養(yǎng)基：酵母粉11.11 g、蛋白胨 11.11 g、蒸餾水 1 L，pH 7.2～7.4，分裝45 mL至250 mL三角瓶中，115 ℃滅菌30 min。配制母液質(zhì)量濃度為100 g/L的L-蘇氨酸，無菌條件下采用0.22 μm水系濾頭過濾后，按5 mL的量進(jìn)行添加，使L-蘇氨酸的終質(zhì)量濃度為10 g/L。

Y-GT培養(yǎng)基：酵母粉11.11 g、蛋白胨 11.11 g、蒸餾水 1 L，pH 7.2～7.4，分裝45 mL至250 mL三角瓶中，115 ℃滅菌30 min。參考上述溶液配制，使培養(yǎng)基中外源添加底物D-葡萄糖和L-蘇氨酸的終質(zhì)量濃度分別為5和10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(SW-CJ-1FD)，蘇州凈化有限公司；高速冷凍離心機(5804R)，德國Eppendorf公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters UPLC/XE O TQ)，美國Waters公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo ScientificTMTrace 1300/ISQ LT)，美國Thermo Fisher公司；恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床(DKY-2)，上海杜科自動化設(shè)備有限公司；分析天平(ME204E)、pH計(FE28)，瑞士Mettler Toledo公司；高壓濕熱自動滅菌鍋(SX-700)、日本Tomy Digital Biology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物批次培養(yǎng)

將B.subtilisNr.5在LB平板上進(jìn)行活化，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至LB試管中，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h獲取種子液。將活化的種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的添加量分別轉(zhuǎn)接至Y-G、Y-T和Y-GT的液體培養(yǎng)基中，同時設(shè)置了一組不接菌的對照組，以消除培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程對目標(biāo)產(chǎn)物吡嗪含量的影響。批次發(fā)酵實驗在500 mL錐形瓶中進(jìn)行，裝液量為100 mL， 37 ℃下200 r/min培養(yǎng)48 h，期間分別在0、6、10、20、31和48 h進(jìn)行取樣，取樣體積為6 mL，對其進(jìn)行細(xì)胞生長密度(OD600 nm)的測定。樣品經(jīng)離心14 000 r/min, 5 min后獲取上清液置于-20 ℃，后續(xù)進(jìn)行吡嗪濃度檢測。上述發(fā)酵組別的樣品均一式三份。

1.3.2 醬油模擬發(fā)酵

參考文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行醬油制曲。稱取50 g成曲，分裝至500 mL錐形瓶中，加入200 mL 180 g/L的鹽水進(jìn)行發(fā)酵。具體操作方法如下：首先，將B.subtilisNr.5在LB平板上進(jìn)行活化，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至LB試管中，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)獲取種子液，測定菌液OD600 nm，待菌液OD值為4.0時，將活化的菌液用生理鹽水清洗2遍后，按體積分?jǐn)?shù)1%的添加量分別轉(zhuǎn)接至上述醬油固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)體系B和C組。同時將等體積生理鹽水加至對照組A中。A、B和C組固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基均放置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。隨后將過濾除菌的外源添加化合物按曲料干質(zhì)量(50 g)的百分比相應(yīng)添加至C組，具體見表1，上述發(fā)酵組別的樣品均一式三份，發(fā)酵30 d，每5 d手動搖動1 min。樣品A、B和C組發(fā)酵30 d后進(jìn)行取樣待測。

表1 醬油發(fā)酵模擬體系Table 1 Simulation system of soy sauce fermentation

1.3.3 吡嗪化合物的定量分析

1.3.3.1 2,3,5-TMP、2,3,5,6-TTMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP的定量分析

樣品預(yù)處理方法：批次發(fā)酵樣品：發(fā)酵液離心，14 000 r/min，5 min后取上清液。將上清液按體積比1∶ 1與乙腈溶液混合，冰浴超聲振蕩20 min，于4 ℃ 12 000 r/min條件下離心30 min，獲取上清液加入進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行LC-MS定量分析。醬油模擬發(fā)酵樣品：醬油模擬發(fā)酵液經(jīng)4層濾紙過濾后，將溶液離心，14 000 r/min, 5 min后得到上清液。上清液直接加到進(jìn)樣瓶中進(jìn)行GC-MS半定量分析；將上清液按如上方法進(jìn)行萃取處理，進(jìn)行LC-MS定量分析。

本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對發(fā)酵液中吡嗪進(jìn)行定量分析。首先，采用正離子模式下Daughters掃描方式獲取4種吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和質(zhì)譜信息。隨后，通過設(shè)定如下的離子對：109→67 (2,5-DMP)、123→81 (2,3,5-TMP)、137→96 (2,3,5,6-TTMP)、137→122 (3,5-EDMP)、137→122 (3,6-EDMP)，采用多反應(yīng)檢測模式(multiple reaction monitoring，MRM)對以上4種化合物進(jìn)行檢測。具體儀器參數(shù)如下：使用Waters BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱，流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液。設(shè)定流動相的初始濃度為95% A；0.1～25 min，95% A～70% A；總計運行25 min，流速設(shè)定為0.15 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜采集方法及參數(shù)設(shè)置：采用二級質(zhì)譜，正離子模式，毛細(xì)管電壓3.05 k , 脫氣速度800 L/h，脫氣溫度350 ℃，錐孔氣流30 L/h，錐孔電壓31 ，碰撞電壓19 ，數(shù)據(jù)收集時間0.2 s，質(zhì)荷比(m/z)40～400。

本研究通過構(gòu)建一系列不同濃度梯度的吡嗪混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，即二甲基吡嗪(包括2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP)、2,3,5-TMP、TTMP、3,5(6)-EDMP。二甲基吡嗪(2,5-DMP為代表)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.1、1、10、50、100、500和800 μg/L以及1、2、5、10和20 mg/L共12個濃度梯度；TMP的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別設(shè)置為 0.1、0.5、1、10、50、100、200、500、800、1 000、2 000和5 000 μg/L共12個濃度梯度；TTMP的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.1、0.2、0.5、0.8、1、10、20、40、50、80、100和200 μg/L共12個濃度梯度；3,5(6)-EDMP的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別設(shè)置為 0.1、0.5、1、10、20、50、80、100、200、500、800和1 000 μg/L共12個濃度梯度；外標(biāo)法實現(xiàn)對烷基吡嗪的定量。

1.3.3.2 2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的定量分析

如上利用液相色譜檢測方法無法實現(xiàn)2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的有效分離，因此，需配合高效氣相、質(zhì)譜對以上3種化合物進(jìn)行定量。樣品預(yù)處理：將發(fā)酵樣品離心，14 000 r/min, 5 min后得到上清液。5 mL樣品中加入5 μL 0.09 g/L的2-甲基-3-甲硫基吡嗪作為內(nèi)標(biāo)。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱型號為DB-WAX (60 m×0.25 mm, 0.25 μm)，柱載氣為He，流速為1.2 mL/min，不分流；升溫程序：50 ℃保持2 min，隨后以3 ℃/min上升到110 ℃，保持5 min，隨后以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min。質(zhì)譜條件如下：電離能70 e ；質(zhì)譜傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度260 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃；掃描時間0.1 s；質(zhì)譜掃描范圍25～350 amu。首先，基于全掃模式(Full scan)，計算2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的峰面積比值；其次，利用液質(zhì)聯(lián)用儀，得到二甲基吡嗪的總濃度；最后，利用二甲基吡嗪總濃度及2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的峰面積比值，計算得到2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的濃度。例如二甲基吡嗪總濃度為M，2,3-DMP峰面積為A1, 2,5-DMP峰面積為A2, 2,5-DMP峰面積為A3。則2,3-DMP濃度按公式(1)計算:

(1)

1.3.4 模擬醬油樣品中風(fēng)味化合物的半定量分析

風(fēng)味化合物半定量分析時的樣品預(yù)處理及樣品檢測方法與2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP的檢測方法一致。2-甲基-3-甲硫基吡嗪作為內(nèi)標(biāo)化合物的濃度已知(終質(zhì)量濃度為0.90 μg/L)，根據(jù)目標(biāo)化合物峰面積(Ai)與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積(Ac)的比值，按公式(2)計算目標(biāo)化合物相對濃度ci:

(2)

1.3.5 醬油理化指標(biāo)檢測

氨基酸濃度的測定：將發(fā)酵30 d模擬醬油發(fā)酵樣品取樣1 mL，14 000 r/min 離心 5 min后取上清液。按體積比1∶1將上清液與體積分?jǐn)?shù)10%磺基水楊酸混勻，4 ℃靜置4 h后置于12 000 r/min條件下，離心10 min，重復(fù)以上步驟2次。吸取上清液1 mL，加入不同體積的0.02 mol/L HCl溶液，將萃取上清液分別稀釋20、30、50倍。稀釋后樣品過0.22 μm水相濾頭至進(jìn)樣瓶中待測。氨基酸分析采用OPA-FMOC柱前衍生的方法，采用高效液相色譜儀系統(tǒng)，搭配Diamonsil C18(250 mm × 4.6 mm， 5 μm)色譜柱。pH測定：直接利用pH計測定醬油發(fā)酵樣品上清液pH。模擬醬油樣品的氨氮濃度及總酸水平按照國標(biāo)法測定，分別為GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》及GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilis Nr. 5具有多種吡嗪合成能力

在微生物發(fā)酵過程中，吡嗪化合物屬于次級代謝產(chǎn)物，化合物質(zhì)量濃度通常較低(ng/L～μg/L)，難以實現(xiàn)精準(zhǔn)定性定量[19]。本研究首先優(yōu)化7種吡嗪檢測方法，包括5種在醬油中有風(fēng)味價值的吡嗪化合物，即2,5-DMP、2,6-DMP、2,3,5-TMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP，另外加上1種2,5(6)-DMP的同分異構(gòu)體—2,3-DMP，及已被證明可以由B.subtilis合成的吡嗪化合物—2,3,5,6-TTMP。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是公認(rèn)的可精準(zhǔn)實現(xiàn)化合物定性定量的檢測設(shè)備。如圖2-a所示，經(jīng)過檢測方法優(yōu)化，本研究可實現(xiàn)二甲基吡嗪(包括2,3/2,5/2,6-DMP)、2,3,5-TMP、2,3,5,6-TTMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP有效分離。然而，2,3-DMP、2,5-DMP及2,6-DMP作為同分異構(gòu)體，具有相似的物化性質(zhì)，無法利用液質(zhì)進(jìn)行有效分離。本研究繼續(xù)研究優(yōu)化高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法，可實現(xiàn)3種二甲基吡嗪有效分離(圖2-b)。最終，本研究同時實現(xiàn)了7種烷基吡嗪的精準(zhǔn)定性定量。

本課題組前期篩選得到1株可高產(chǎn)3,5-EDMP及3,6-EDMP的菌株，根據(jù)分子生物學(xué)及生理生化分析，鑒定并命名為B.subtilisNr.5[16]，本研究繼續(xù)探究B.subtilisNr. 5的吡嗪合成能力，檢測B.subtilisNr. 5在基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基中及添加了D-葡萄糖及L-蘇氨酸(已解析的烷基吡嗪合成底物)的培養(yǎng)基的吡嗪合成能力。如圖3所示，未接種B.subtilisNr. 5的各培養(yǎng)基中均未檢出吡嗪化合物，表明在常溫常壓下，吡嗪化合物的合成必須有微生物參與。D-葡萄糖及L-蘇氨酸的添加未對微生物的生長產(chǎn)生影響(圖3-a)。值得注意的是，B.subtilisNr. 5在發(fā)酵20～30 h時，達(dá)到最高細(xì)胞濃度，隨后細(xì)胞濃度緩慢下降。與此同時，大部分吡嗪在20 h后開始大量合成。如上結(jié)果與吡嗪化合物為次級代謝產(chǎn)物，微生物發(fā)酵提供吡嗪化合物合成必要前體的前期結(jié)論一致[15]。

如圖3-b～3-f所示，培養(yǎng)基中添加D-葡萄糖可有效促進(jìn)B.subtilisNr. 5合成2,3,5,6-TTMP。培養(yǎng)基中添加L-蘇氨酸可有效促進(jìn)菌株合成2,5-DMP及3,6-EDMP(圖4)。在同時添加了L-蘇氨酸及D-葡萄糖的培養(yǎng)基中，7種目標(biāo)烷基吡嗪合成均得到顯著提高，其中2,5-DMP及2,3,5-TMP最高質(zhì)量濃度均達(dá)到100 mg/L以上。結(jié)果表明，B.subtilisNr. 5在添加D-葡萄糖及L-蘇氨酸條件下，可以至少合成2,3-DMP、2,5-DMP、2,6-DMP、2,3,5-TMP、2,3,5,6-TTMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP共7種吡嗪化合物，其中，48 h內(nèi) 2,5-DMP、2,3,5-TMP、3,5-EDMP及3,6-EDMP的合成質(zhì)量濃度均>1 mg/L。

a-不同吡嗪在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的出峰時間；b-不同二甲基吡嗪在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的出峰時間圖2 檢測條件優(yōu)化實現(xiàn)烷基吡嗪有效分離Fig.2 The optimization of detection methods realized the separation of pyrazine peaks

圖3 B.subtilis Nr. 5的生長曲線及產(chǎn)吡嗪能力分析Fig.3 The growth and pyrazine production cur es of B.subtilis Nr. 5注：K-G：培養(yǎng)基為LB添加D-葡萄糖，無微生物接種；K-T:培養(yǎng)基為LB添加L-蘇氨酸，無微生物接種；K-GT:培養(yǎng)基為LB添加D-葡萄糖及L-蘇氨酸，無微生物接種；S-G：培養(yǎng)基為LB添加D-葡萄糖，接種B.subtilis Nr.5; S-T：培養(yǎng)基為LB添加L-蘇氨酸，接種B.subtilis Nr.5; S-GT：培養(yǎng)基為LB添加D-葡萄糖及L-蘇氨酸，接種B.subtilis Nr.5(下同)

a-2,3-二甲基吡嗪；b-2,5-二甲基吡嗪；c-2,6-二甲基吡嗪圖4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵48 h合成的二甲基吡嗪濃度Fig.4 The production of dimethylpyrazines by B.subtilis Nr. 5注：空白，培養(yǎng)基為LB添加D-葡萄糖及L-蘇氨酸，無微生物接種

2.2 醬油模擬發(fā)酵體系中接種B.subtilis Nr. 5

B.subtilisNr. 5有多吡嗪產(chǎn)生能力，接種B.subtilisNr. 5是否在醬油發(fā)酵中具有提升吡嗪化合物合成能力的有效策略值得探究。基于工業(yè)生產(chǎn)醬油的合成工藝，本研究構(gòu)建模擬醬油發(fā)酵體系，設(shè)置不添加B.subtilisNr. 5發(fā)酵劑的樣品為對照，經(jīng)過30 d保溫發(fā)酵，研究B.subtilisNr. 5菌株加入對醬油中吡嗪化合物濃度的影響。發(fā)酵后，未接種樣品(pH 4.50)與接種樣品(pH 4.55) 的pH一致，未接種樣品總酸質(zhì)量濃度(以乙酸計)為(0.45±0.03) g/100 mL，接種樣品總酸質(zhì)量濃度為(0.22±0.03) g/100 mL，總酸水平略有下降，可能與枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生pH中性化合物有關(guān)。如表2所示，氨基酸種類及濃度未有明顯差異。在吡嗪化合物合成方面，2,5-DMP質(zhì)量濃度由0.41 μg/L提高到7.74 μg/L，提高了18.88倍。2,3,5-TMP質(zhì)量濃度由0.39 μg/L提高到1.29 μg/L，提高了3.31倍，其余吡嗪濃度沒有明顯提高(圖5)。結(jié)果表明，在醬油發(fā)酵過程中，只添加可合成吡嗪的發(fā)酵劑，可提升部分吡嗪合成濃度。

圖5 模擬醬油樣品中吡嗪化合物質(zhì)量濃度Fig.5 The concentration of pyrazines in stimulate soy sauce samples注：A樣品：未添加發(fā)酵劑及吡嗪合成底物的模擬醬油體系；B樣品：添加了發(fā)酵劑(B. subtilis Nr. 5)的模擬醬油體系；C樣品：添加了發(fā)酵劑(B. subtilis Nr. 5)及吡嗪合成底物(D-葡萄糖、L-氨基酸及銨鹽)的模擬醬油發(fā)酵體系(下同)

2.3 發(fā)酵劑及發(fā)酵底物添加提升模擬醬油體系中吡嗪化合物濃度

本研究分析同時加入發(fā)酵劑及發(fā)酵底物對醬油發(fā)酵體系中吡嗪化合物合成的影響。經(jīng)過30 d發(fā)酵，同時加入L-蘇氨酸、D-葡萄糖及B.subtilisNr.5的模擬醬油發(fā)酵樣品pH值為4.61，總酸(以乙酸計)質(zhì)量濃度為(0.32±0.01) g/100 mL，與未添加底物及菌株的樣品相比pH接近(pH 4.50)，總酸略有下降[未接種樣品總酸質(zhì)量濃度為(0.45±0.03) g/100 mL]。未添加底物及菌株的氨基酸質(zhì)量濃度為(8.32±0.09) g/L，氨基酸態(tài)氮水平為(0.10±0.01) g N/100 mL, 添加了底物及菌株的氨基酸質(zhì)量濃度為(10.81±0.10) g/L，氨基酸態(tài)氮水平為(0.12±0.01) g N/100 mL。因此，底物及菌株的添加使得氨基酸濃度及氨氮水平均略有提升，可能與添加底物蘇氨酸有關(guān)。從醬油發(fā)酵合成吡嗪種類及濃度來看，如圖5所示，多種吡嗪化合物質(zhì)量濃度得到明顯提高。二甲基吡嗪中，2,3-DMP質(zhì)量濃度由0.12 μg/L提高至0.30 μg/L，提高2.50倍；2,5-DMP質(zhì)量濃度由0.41 μg/L提高至11.31 μg/L，提高27.59倍；2,6-DMP質(zhì)量濃度由1.13 μg/L提高至14.03 μg/L，提高了12.42倍。2,3,5-TMP質(zhì)量濃度由0.39 μg/L提高至2.93 μg/L，提高了7.52倍。2,3,5,6-TTMP質(zhì)量濃度由0.06 μg/L提高至0.18 μg/L，提高了3倍。3,5-EDMP及3,6-EDMP質(zhì)量濃度分別由0.09及0.10 μg/L提高至0.59及1.64 μg/L，分別提高了6.56及16.4倍。吡嗪總質(zhì)量濃度由2.3 μg/L提高到30.98 μg/L，提高了12.46倍。結(jié)果表明，同時添加發(fā)酵劑及發(fā)酵底物，有希望實現(xiàn)釀造醬油中吡嗪化合物種類及濃度的提升。另外，2,3-DMP及2,6-DMP的微生物合成途徑尚未解析，本研究有利于重要吡嗪化合物的微生物合成途徑解析。

表2 模擬發(fā)酵30 d的醬油中氨基酸質(zhì)量濃度Table 2 The concentration of amino acid in stimulate soy sauce fermentation at 30th days

2.4 接種B.subtilis Nr.5對模擬醬油中風(fēng)味化合物合成的影響

除吡嗪外，有眾多其他風(fēng)味化合物貢獻(xiàn)了醬油風(fēng)味，包括酸、醇、醛、酯和呋喃等雜環(huán)化合物。本研究進(jìn)一步解析發(fā)酵劑B.subtilisNr.5及發(fā)酵底物的添加對其他風(fēng)味化合物形成的影響。如表3所示，同時添加發(fā)酵劑及發(fā)酵底物，醇類、酸類、酯類、吡嗪類、呋喃類雜環(huán)化合物濃度提高，醛類化合物濃度降低。酯類化合物是醬油發(fā)酵中的重要風(fēng)味化合物，與未添加的模擬醬油發(fā)酵樣品相比，添加了B.subtilisNr.5、L-蘇氨酸及D-葡萄糖的樣品中，2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯及己酸乙酯濃度提高了50%以上，棕櫚酸乙酯濃度提升了2.46倍。值得注意的是，吡嗪化合物中，除已定量的7種吡嗪化合物，另檢測發(fā)現(xiàn)，甲基吡嗪及2-乙基-6-甲基吡嗪濃度提高，濃度提升比例分別為 1.35及7.82倍。結(jié)果表明，同時接種B.subtilisNr.5及發(fā)酵底物，會促進(jìn)多種風(fēng)味化合物合成。

表3 模擬發(fā)酵30天的醬油體系中風(fēng)味化合物種類及質(zhì)量濃度Table 3 The ariety and concentration of olatile compounds in stimulate soy sauce fermentation at 30th days

3 結(jié)論

本研究在篩選得到1株可合成多種吡嗪化合物的微生物菌株基礎(chǔ)上，通過模擬醬油發(fā)酵方式，探究基于微生物應(yīng)用的提升醬油發(fā)酵過程中吡嗪化合物的合成策略。研究發(fā)現(xiàn)，醬油發(fā)酵過程中，同時添加可合成吡嗪的發(fā)酵劑B.subtilisNr.5及發(fā)酵底物L(fēng)-蘇氨酸及D-葡萄糖，可有效提升醬油中吡嗪化合物的種類及濃度。本研究一方面開發(fā)了發(fā)酵醬油中吡嗪化合物濃度提升策略；另一方面，對多種吡嗪化合物的微生物合成機制以及醬油中已有吡嗪化合物的合成途徑研究有借鑒意義。