左學(xué)麗，李旭青，楊海寧，楊燕萍，魏 萊，曾麗倩，車永和

（1.河北科技師范學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），河北 秦皇島 066000； 2.青海省互助北山林場 青海 海東 810500）

冰草屬（Agropyron）植物屬于禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）中的一種［1］，我國冰草屬物種主要分為冰草（A. cristatum L.）、沙生冰草（A. desertorum ＜Fisch.＞ Schult.）、 根 莖 冰 草（A. michnoi Roshev.）、西伯利亞冰草（A. fragile ＜Roth＞ Canad.）、蒙古冰草（A. mongolicum Keng）5 個(gè)種，以及多花冰草（A. cristatum var. lurflorum）、光穗冰草（A. cristatum var. pecriforme）、毛沙生冰草（A. desertorum var. pilosiusculum）、和毛沙蘆冰草（A. desertorum var. vilosum）4 個(gè)變種和毛稃冰草（A. sibiricumf. pubiflorum）1 個(gè)變型。其中冰草是冰草屬中分布范圍最廣泛的1 個(gè)種，是冰草屬代表物種，而蒙古冰草分布于我國的內(nèi)蒙古，陜西等地區(qū)，適應(yīng)于干燥的草原或沙地，是我國1 個(gè)特有種［2］。

冰草屬植物作為優(yōu)異的小麥三級基因源，在小麥與冰草遠(yuǎn)緣雜交染色體間關(guān)系研究上［3-8］有較多研究報(bào)道。有目的的導(dǎo)入冰草外源基因?yàn)樾←溣N和品種改良提供了新的途徑［9］，小麥冰草遠(yuǎn)緣雜交系統(tǒng)深入研究不僅為小麥異染色體材料的鑒定和利用提供了有用的工具，而且為小麥育種和改良提供了新的種質(zhì)資源。針對冰草屬植物細(xì)胞學(xué)［10］、分子生物學(xué)［11-12］、基因組學(xué)［13］等方面的研究報(bào)道相對還是較少。關(guān)于冰草屬的分類在學(xué)術(shù)界始終存在分歧，對冰草屬植物在基因組系統(tǒng)進(jìn)化方面依然還存在較大爭論［14-16］。針對冰草與蒙古冰草雜種后代研究有助于闡明沙生冰草、根莖冰草等冰草屬多倍體物種起源進(jìn)化，在冰草屬植物系統(tǒng)演化中有重要研究意義。

核型分析作為一種常用的細(xì)胞分析方法，能對植物進(jìn)化程度，種屬間的親緣關(guān)系更好地分類，但目前尚沒見對冰草屬典型二倍體物種間的核型分析報(bào)道。本研究針對冰草屬兩個(gè)典型二倍體物種冰草和蒙古冰草及其種間雜種的F2代核型進(jìn)行分析，以期確定研究材料的染色體組成及多態(tài)性情況、為冰草屬植物遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料由中國農(nóng)科院作物研究所提供，以蒙古冰草（A. mongolicum）Z2098 為母本與二倍體冰草 （A. cristatum）Z1842 為父本進(jìn)行人工雜交獲得種間雜種F1代群體。試驗(yàn)材料種植于河北科技師范學(xué)院農(nóng)場。對父母本及在F1代種間雜種群體116 個(gè)單株中隨機(jī)選取3 個(gè)單株的結(jié)實(shí)種子，即F2代材料進(jìn)行發(fā)根。

1.2 細(xì)胞學(xué)制片方法

每份冰草材料挑選籽粒飽滿、無病蟲害50 種子，清水洗后放于雙層濾紙培養(yǎng)皿內(nèi)室內(nèi)進(jìn)行發(fā)根。具體方法參照代明等染色體核型分析方法［17］。

1.3 染色體核型分析方法

參照李懋學(xué)等確定的染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)［18］，對圖像編號并測量相對長度、臂比、核型類型及核不對稱系數(shù)等指標(biāo)［19-21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目分析

每份材料選擇對50 個(gè)分散良好的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)（圖1 ～5），其中父本冰草Z1842 中有43 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14 條，占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86%，5 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為12 條，2 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為10條，分別占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的10%和4%。母本蒙古冰草Z2098 中有43 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14 條，占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86%，4 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為12 條，3 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為11 條，分別占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的8%和6%。隨機(jī)選取的雜種F2-19 中有43 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14 條，3 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為12 條，2 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為10 條，2 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為7 條，分別占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86%、6%、4%、和4%。雜種F2-69中有43 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14 條，有4 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為12 條，有3 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為9 條，分別占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86%、8%和6%。雜種F2-94 中有44 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14 條，有1 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為13 條，有5 個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為12 條，占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的88%、2%和10%。根據(jù)染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)，85%以上的細(xì)胞具有恒定不變的染色體數(shù)目時(shí)認(rèn)定為該植物體的染色體數(shù)目，因此確定本研究冰草屬兩個(gè)代表物種及其種間雜種F2代的染色體數(shù)目為2n=2x=14。

圖1 冰草Z1842 的核型分析圖Fig. 1 Karyotype analysis of A. cristatum Z1842

圖2 蒙古冰草Z2098 的核型分析圖Fig. 2 Karyotype analysis of A. mongolicum Z2098

圖3 冰草雜種F2-19 的核型分析圖Fig. 3 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-19

圖4 冰草雜種F2-69 的核型分析圖Fig. 4 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-69

圖5 冰草雜種F2-94 的核型分析圖Fig. 5 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-94

2.2 染色體核型分析

用Photoshop 軟件每份材料測量5 個(gè)細(xì)胞染色體的長臂、短臂長度，取平均值，并計(jì)算每條染色體的臂比值（長臂/短臂），確定著絲粒位置類型，分析結(jié)果見表1 和表2。

表1 冰草屬物種及其種間雜種F2 代染色體核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of Agropyron spp. and the interspecific hybrid F2

續(xù)表：

表2 研究材料的染色體核型對比Table 2 Comparison of karyotypes of the study materials

2.2.1 冰草雜種父本的核型 在父本冰草Z1842 材料中，染色體相對長度最長的為16.20%，最短的為12.41%，比值為1.31；臂比中最長臂比為1.8，最短的臂比為1.51，不存在臂比值大于2.1 的染色體，屬于“1A”型；Z1842 染色體的不對稱系數(shù)為61.70%，對稱性較強(qiáng)，屬于較對稱類型范圍。第5、6 對染色體著絲點(diǎn)在近中部染色體區(qū)域，其余著絲點(diǎn)在中部染色體區(qū)域，核型公式為2n=2x=10m+4sm。

2.2.2 冰草雜種母本的核型 在母本蒙古冰草Z2098 中，染色體相對長度最長的為18.13%，最短的為11.95%，比值為1.52；臂比中最長臂比為1.74，最短的臂比為1.52，不存在臂比值大于2∶1 的染色體，屬于“1A”型；Z2098 染色體的不對稱系數(shù)為62.10%，對稱性較強(qiáng)，屬于較對稱類型范圍。第2、3、6、7 對染色體的著絲點(diǎn)在中部染色體區(qū)域，其余染色體的著絲點(diǎn)在近中部染色體區(qū)域，其核型公式為2n=2x=8m+6sm。

2.2.3 冰草雜種F2-19 號的核型 在冰草雜種19 號中，染色體相對長度最長的為18.84%，最短的為12.30%，比值為1.53；臂比中最長臂比為1.64，最短的臂比為1.32，不存在臂比大于2∶1 的染色體，屬于“1A”型；冰草雜種母本材料染色體的不對稱系數(shù)為59.27%，對稱性較強(qiáng)，屬于較對稱類型范圍。7 對染色體的著絲點(diǎn)在中部染色體區(qū)域，核型公式為2n=2x=14m。

2.2.4 冰草雜種F2-69 號的核型 在雜種69 號中，染色體相對長度最長的為16.34%，最短的為12.86%，比值為1.27；臂比中最長臂比為2.08，最短的臂比為1.73，有2 對臂比大于2∶1 的染色體，屬于“2A”型；雜種69 號材料染色體的不對稱系數(shù)為64.90%，對稱性較強(qiáng)，屬于較對稱類型范圍。全部染色體的著絲點(diǎn)在近中部染色體區(qū)域，核型公式為2n=2x=14sm。

2.2.5 冰草雜種F2-94 號的核型 在冰草雜種94 號中，染色體相對長度最長的為21.37%，最短的為10.65%，比值為2.01；臂比中最長臂比為2.03，最短的臂比為1.34，有2 對臂比大于2∶1 的染色體，屬于“2A”型；冰草雜種94 號材料染色體的不對稱系數(shù)為64.51%，對稱性較強(qiáng)，屬于較對稱類型。除了第1、2、3 和4 對染色體的著絲點(diǎn)在中部染色體區(qū)域，其余染色體的著絲點(diǎn)在近中部染色體區(qū)域，核型公式為2n=2x=6m+8sm。

2.3 染色體核型聚類分析

聚類分析研究表明（圖6），在歐式距離為2處，可將研究材料分為三類，種間雜種F2-69 和F2-94 為一類，核不對稱系數(shù)較高，分別為64.90%和64.51%，表明遺傳差異大，進(jìn)化程度較最高。父本Z1842 與母本Z2098 為一類，核不對稱系數(shù)居中（61.70%、62.10%），進(jìn)化程度小于F2-69 和F2-94。F2-19 號單獨(dú)為一類，核不對稱系數(shù)最低（64.51%），進(jìn)化程度最低。在歐式距離13 處，可將5 份研究材料分為兩類，父本、母本與F2-19 號材料為一類，核型類型為1A 型；其余的材料為一類，核型類型為2A 型。

圖6 研究材料聚類分析Fig. 6 Cluster analysis of the study materials

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞學(xué)作為植物遺傳多樣性的一種研究方法，是通過比較染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)的變化，來反映染色體的遺傳規(guī)律。核型分析是定性和定量的分析和研究生物的染色體核型，在植物細(xì)胞的核型分析中，主要是從染色體的全長、臂長、著絲點(diǎn)位置以及特殊的結(jié)構(gòu)幾方面進(jìn)行研究的［22-23］。通過研究和對比物種間的染色體核型來確定本物種的自身遺傳特征，為物種間的系統(tǒng)演化與親緣關(guān)系的判斷提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，冰草屬蒙古冰草和冰草及其雜種后代F2材料體細(xì)胞染色體數(shù)目都為2n=2x=14，其核對稱水平都較高，染色體相對長度、臂比、不對稱系數(shù)都有一定的差異。相關(guān)研究中，對冰草居群細(xì)胞學(xué)核型分析發(fā)現(xiàn)不同居群之間存在著較大的遺傳差異性［24］；冰草染色體核型主要由中部著絲點(diǎn)（m）和近中部著絲點(diǎn)染色體（sm）所組成，中部著絲點(diǎn)染色體是冰草核型的主要組成部分［25］。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)冰草屬2 個(gè)典型二倍體物種冰草和蒙古冰草及其種間雜種后代材料核型均屬于基本對稱類型。本研究采用種間雜種后代遺傳分化最為顯著的一個(gè)分離世代F2代進(jìn)行了取樣研究，通過研究發(fā)現(xiàn)形成的后代具有相似的核型特征。研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了冰草屬物種具有相似基因組構(gòu)成，參照前人研究結(jié)果可能由同一基因組演化為不同種及類型［26-27］。

整個(gè)植物界中核型進(jìn)化的基本趨勢是從對稱型發(fā)展為不對稱型，大多數(shù)較為原始的植物具有更對稱的核型，而不對稱的核型在衍生或進(jìn)化的高級植物中更常見［28］。同一屬不同物種之間核型的演變時(shí)經(jīng)常表現(xiàn)出多種形式，在大多數(shù)種情況下核型也由對稱演變?yōu)椴粚ΨQ，而少數(shù)植物則相反。本研究的5 份材料中核不對稱系數(shù)最低的是冰草雜種F2-19號材料為59.27%，核型類型為1A；核不對稱系數(shù)最高的是冰草雜種F2-69 號材料為64.90%，核型類型為2A；冰草和蒙古冰草的核不對稱系數(shù)居中。分析造成本研究材料間核型差異的原因可能主要有，冰草是異花授粉植物具有嚴(yán)格自交不親和性，致使每份材料相對都是一個(gè)雜合體；授粉過程中，不同 種、開花時(shí)間、天氣狀況等不同都會(huì)直接或間接的影響植物的授粉，導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)就比較復(fù)雜；可能不同種材料或是同一種材料應(yīng)用不同的處理方式，也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同；另外，從生物進(jìn)化論的觀點(diǎn)來看，任何物種都不是一成不變的，由于同一物種的生活環(huán)境不同，可能會(huì)導(dǎo)致染色體水平變 化［29］。相關(guān)研究還有待于進(jìn)一步深入。

冰草作為一種牧草和小麥遺傳改良的重要資源，物種細(xì)胞學(xué)的多樣性也顯示了物種基因水平的多樣性。本研究中不同材料之間染色體核型多態(tài)性豐富，研究對冰草屬植物種質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化，種間關(guān)系以及遺傳多樣性提供了一定理論依據(jù)，也為進(jìn)一步拓寬牧草植物育種遺傳基礎(chǔ)提供了一定借鑒意義。