馬自飛，宋文騰，史美華，白菁華，路文靜，肖 凱

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001; 2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001)

轉(zhuǎn)錄因子 (TFs) 又稱反式作用因子，通過與下游啟動子區(qū)順式作用元件結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，在介導(dǎo)植株生長、發(fā)育和抵御非生物逆境中發(fā)揮重要功能［1］。核因子 (NF-Y) 由NF-YA、NF-YB 和NFYC 3 種亞基組成三聚體形式，與細(xì)胞核內(nèi)下游基因啟動子中順式元件CCAAT 盒特異互作，參與對植株生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)［2］。對小麥種屬研究表明，該種屬含有10 個NF-YA 家族基因，11 個NF-YB 家族基因和14 個NF-YC 家族基因［3］。功能鑒定結(jié)果表明，NF-Y 家族成員廣泛參與植株生長、發(fā)育和逆境抵御等眾多生物學(xué)過程的調(diào)控。其中，NF-YA家族基因參與植株配子發(fā)生、胚胎發(fā)育、種子發(fā)育和開花［4-6］、豆科植物器官建成和共生根瘤等過 程［7］；NF-YB 家族成員與植株開花［8］、胚乳發(fā) 育［9］、根系伸長［10］、光合作用和光形態(tài)建成過程密切相關(guān)［11］；NF-YC 蛋白參與花器官建成和細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)［12］。此外，NF-Y 家族成員通過調(diào)控下游逆境防御基因轉(zhuǎn)錄，廣泛參與植株適應(yīng)和防御非生物逆境過程。如擬南芥AtNF-YA5在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞呈干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式，通過加快氣孔關(guān)閉速率增強植株抗旱功能［13］。大豆GmNFYA3 表達(dá)受到多種脅迫處理誘導(dǎo)，過表達(dá)該基因株系中部分干旱響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，植株水分利用效率顯著提高［14］。表明植物NF-Y 家族成員在介導(dǎo)植株抵御非生物逆境能力中發(fā)揮重要調(diào)控效應(yīng)。小麥?zhǔn)俏覈匾Z食作物，增強該作物抗旱耐鹽能力對于保障我國糧食安全具有重要實踐價值。本研究針對迄今有關(guān)麥類種屬NF-YC 家族成員功能研究尚少的現(xiàn)狀，以前期鑒定的小麥NF-YC 家族 成員TaNF-YC1 為基礎(chǔ)，對該基因分子特征、應(yīng)答滲透脅迫表達(dá)模式及介導(dǎo)植株抵御滲透脅迫能力進(jìn)行研究，旨在為今后小麥抗旱和耐鹽遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TaNF-YC1 的系統(tǒng)進(jìn)化特征分析

利用Protparam 在線分析供試基因 TaNF-YC1 ( 登錄號：KJ862216) 編碼蛋白的等電點和分子量。以TaNF-YC1 cDNA 序列為基礎(chǔ)，對NCBI中GenBank 進(jìn)行同源基因查找，獲得與該小麥轉(zhuǎn)錄因子基因同源的植物種屬基因，采用DNAStar軟件建立供試基因與其植物種屬同源基因的系 統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2 TaNF-YC1 應(yīng)答滲透脅迫的表達(dá)模式研究

以小麥品種‘石麥22’為材料，參照本實驗室建立的方法，用MS 營養(yǎng)液水培小麥幼苗。三葉期時，在營養(yǎng)液內(nèi)補充5%聚乙二醇（PEG-6000）和200 mmol/L NaCl 進(jìn)行干旱和鹽分處理。處理1、3、 9 和27 h 后收獲根系樣本，研究TaNF-YC1 應(yīng)答滲透脅迫的表達(dá)模式；為揭示供試基因?qū)謴?fù)處理的響應(yīng)，將部分經(jīng)27 h 滲透脅迫處理的幼苗轉(zhuǎn)入正常MS 營養(yǎng)液進(jìn)行恢復(fù)處理，處理后1、3、9 和27 h收獲根系樣本。以滲透脅迫處理前 (0 h) 根系作對照。采用TRIzol 試劑提取樣本總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 進(jìn)行樣本mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照Guo 等的方法［15］，鑒定各樣本TaNF-YC1 轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，擴增引物見表1。以小麥組成型表達(dá)基因Tatubulin 作為均一化目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本內(nèi)標(biāo)，擴增該內(nèi)標(biāo)基因引物見表1。各處理下目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)轉(zhuǎn)錄本檢測均進(jìn)行3 次重復(fù)。

表 1 試驗用PCR 引物Table 1 PCR primers used in this study

1.3 TaNF-YC1 編碼蛋白亞細(xì)胞定位研究

通過檢測TaNF-YC1 與綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）報告基因融合蛋白（TaNF- YC1-GFP）在細(xì)胞內(nèi)位置，明確TaNF-YC1 蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分選后的亞細(xì)胞定位特征。方法如下：采用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體 pCAMBIA1300-TaNF-YC1-GFP。采用PCR 技術(shù)擴增TaNF-YC1 編碼區(qū)，擴增引物見表1。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后48 h，用激光共聚焦顯微鏡 (FV10-ASW, OLYMPUS) 檢測融合蛋白信號。以pCAMBIA1300-GFP 空載體作對照。

1.4 干旱和鹽分處理下TaNF-YC1 轉(zhuǎn)基因植株表型和生物學(xué)性狀分析

以干旱處理小麥根系cDNA 為模板，采用RTPCR 技術(shù)擴增TaNF-YC1 的編碼閱讀框 (ORF) 正、反義序列。采用的引物見表1。利用DNA 重組技術(shù)，構(gòu)建基因正義和反義表達(dá)質(zhì)粒。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，建立將TaNF-YC1 正、反義序列轉(zhuǎn)化至煙草（cv. Wiscosin 35）的轉(zhuǎn)基因植株。具體過程參照Sun 等的方法［16］進(jìn)行。

以典型轉(zhuǎn)化TaNF-YC1 T3 正義煙草植株Sen 1、反義煙草植株Anti 1 和野生型（WT）煙草植株為材料，參照Sun 等的方法［17］，采用溶液培養(yǎng)法培養(yǎng)供試材料至5 葉期。然后，部分植株繼續(xù)進(jìn)行正常培養(yǎng)處理，另將部分長勢均勻植株轉(zhuǎn)入含有5% PEG-6000 和150 mmol/L NaCl 的MS 營養(yǎng)液中進(jìn)行干旱和鹽分處理。正常生長和滲透脅迫處理4 周，用相機對不同處理供試材料照相，記錄植株長勢。另選取各處理供試材料代表性植株3 株稱取鮮重，然后將植株樣本烘干稱重，獲得植株干重。各處理轉(zhuǎn)化株系和WT 測試均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.5 干旱和鹽分處理下轉(zhuǎn)基因植株光合參數(shù)測定

以正常生產(chǎn)和逆境處理下轉(zhuǎn)基因植株上位功能葉為測試對象，參照Guo 等的方法［15］，測定不同處理下轉(zhuǎn)基因植株和WT 的光合參數(shù)。包括光合速率 (Pn)、光系統(tǒng)II 光化學(xué)活性 (ΨPSII) 和葉綠素非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ)。各處理轉(zhuǎn)化株系和WT 測試均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.6 干旱處理下轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔關(guān)閉特征和失水率測定

以正常生長條件下TaNF-YC1 正義煙草轉(zhuǎn)基因株系Sen 1、反義煙草轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)nti 1 和WT 為材料，將供試材料進(jìn)行干旱處理，利用顯微鏡觀測處理前 (0 h)和處理后0.5、1 和2 h 各時間點的氣孔開度特征。測試不同時間點 (0 min、10 min、20 min、 30 min、1 h、1.5 h、2 h 和3 h) 葉片鮮重，計算供試材料植株葉片的失水率。各處理轉(zhuǎn)化株系和WT測試均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

采用Microsoft Excel 和DPS 7.05 軟件處理和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。各測定數(shù)據(jù)均源于3 次測試重復(fù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNF-YC1 系統(tǒng)進(jìn)化特征

TaNF-YC1 cDNA 全長839 bp，開放閱讀框為771 bp，編碼256 個氨基酸殘基。該基因編碼蛋白分子量為28.44 kD，等電點pI 為5.12。蛋白結(jié)構(gòu)保守域預(yù)測分析表明，TaNF-YC1 蛋白含有一個保守HAP5 結(jié)構(gòu)域 (87 ～183 aa)，歸屬于CCAAT 盒結(jié)合的NF-Y 型轉(zhuǎn)錄因子家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaNF-YC1 與大豆、百慕大草和玉米等植物種屬的NF-YC 家族基因在核苷酸序列組成上具有較高一致性 (圖1)，TaNF-YC1 可能與上述成員具有相似的進(jìn)化途徑。

圖1 TaNF-YC1 與其植物種屬同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.1 The relations among TaNF-YC1 and its homologous genes in plant species

2.2 TaNF-YC1 應(yīng)答滲透逆境表達(dá)模式

表達(dá)模式分析表明，正常生長條件下，小麥根系中的TaNF-YC1 轉(zhuǎn)錄水平相對較低；干旱和鹽分處理下，TaNF-YC1 表達(dá)被誘導(dǎo)，表現(xiàn)在27 h 處理時間內(nèi)該基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式；將滲透脅迫植株轉(zhuǎn)入正常生長條件進(jìn)行恢復(fù)處理后，該基因表達(dá)逐漸下調(diào) (圖2)。上述結(jié)果表明，TaNF-YC1 表達(dá)呈典型的滲透脅迫應(yīng)答模式。

圖2 TaNF-YC1 應(yīng)答干旱和鹽分脅迫逆境的表達(dá)模式Fig. 2 Expression patterns of TaNF-YC1 under the drought and salt treatments

2.3 TaNF-YC1 編碼蛋白亞細(xì)胞定位及滲透逆境處理下轉(zhuǎn)基因植株生長特征

采用試驗方法鑒定TaNF-YC1-GFP 融合蛋白的亞細(xì)胞位置。結(jié)果表明，融合蛋白GFP 信號僅在細(xì)胞核內(nèi)得到檢測 (圖3A)，這與TaNF-YC1 歸屬轉(zhuǎn)錄因子在核中調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的特征相吻合。采用溶液培養(yǎng)法，鑒定了遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YC1 對植株抵御干旱和鹽分逆境的影響。結(jié)果表明，與野生型（WT）相比，正義轉(zhuǎn)化供試基因的煙草植株 (Sen 1)干旱和鹽分處理下植株長勢明顯增強 (圖3B)；與此相反，干旱和鹽分處理下，反義轉(zhuǎn)化TaNF-YC1 的煙草植株 (Anti 1) 則較WT 植株長勢顯著變差 (圖3B)。結(jié)果表明TaNF-YC1 在介導(dǎo)植株抵御干旱和鹽分脅迫過程中發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。

圖3 TaNF-YC1 編碼蛋白亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽分處理下植株長勢Fig. 3 The subcellular location of TaNF-YC1 and phenotypes of transgenic TaNF-YC1 plant under drought and salt treatments

對不同處理下轉(zhuǎn)基因植株和WT 的單株鮮重、干重和葉面積測定結(jié)果表明，正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因植株與WT 的上述植株性狀無明顯差異 (圖4A)。干旱和鹽分處理下，與WT 相比，Sen 1 單株鮮重和干重增加，植株上、中和下位葉葉面積增大 (圖4B)；Anti 1 則表現(xiàn)為單株鮮重和干重降低，植株各位置葉片的葉面積減小 (圖4C)。上述植株性狀表現(xiàn)特征與前述植株長勢相一致。

圖4 干旱和鹽分處理下TaNF-YC1 轉(zhuǎn)基因植株生長參數(shù)Fig.4 Plant growth traits of the TaNF-YC1 transformed plant under drought and salt treatments

2.4 干旱和鹽分處理下轉(zhuǎn)基因植株光合特性

對正常生長和干旱及鹽分處理下轉(zhuǎn)基因植株的光合碳同化特性進(jìn)行了測定。從結(jié)果可看出（圖5），與WT 相比，正常生長條件下轉(zhuǎn)基因植株 (Sen 1 和Anti 1) 的光合速率 (Pn)、光系統(tǒng)II 光化學(xué)效率 (ΨPSII) 和葉綠素非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ) 與WT 相似。但在干旱和鹽分處理下，與WT 相比，Sen 1 植株 Pn和ΨPSII 顯著增高、NPQ 降低，Anti 1 植株P(guān)n 和ΨPSII 顯著下降、NPQ 增高。結(jié)果表明，TaNF-YC1對滲透逆境下植株光合能力具有較大的調(diào)控效應(yīng)。

圖 5 鹽分和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的光合參數(shù)Fig.5 Photosynthetic parameters of the transgenic plant under salt and drought treatments

2.5 干旱處理下轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔關(guān)閉及失水特征

以干旱處理下轉(zhuǎn)基因植株和WT 植株葉片為材料，對TaNF-YC1 介導(dǎo)植株氣孔關(guān)閉特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在2 h 逆境處理時間內(nèi)，隨著處理進(jìn)程，供試材料氣孔均呈開度逐漸變小特征。與WT 相比，正義煙草植株 (Sen 1) 氣孔隨處理進(jìn)程的關(guān)閉速率加快，而反義植株 (Anti 1) 氣孔隨處理進(jìn)程的關(guān)閉速率變慢 (圖6A)。表明TaNF-YC1 對干旱脅迫下的植株氣孔運動特征產(chǎn)生重要調(diào)控。對干旱處理下轉(zhuǎn)基因植株和WT 葉片失水率測試結(jié)果表明，隨著3 h處理進(jìn)程，Sen 1 失水率低于WT，而Anti 1 的失水率則高于WT (圖6B)。表明TaNF-YC1 調(diào)控干旱處理下氣孔運動進(jìn)而調(diào)節(jié)植株持水能力，是其介導(dǎo)植株抵御滲透脅迫的重要基礎(chǔ)。

圖6 滲透脅迫處理下轉(zhuǎn)基因植株的氣孔關(guān)閉特征和 葉片失水率Fig. 6 Stomatal closure properties and leaf water loss rates in transgenic plant under osmotic stress treatments

3 討論與結(jié)論

特定NF-Y 型轉(zhuǎn)錄因子家族基因通過在轉(zhuǎn)錄水平上對非生物逆境產(chǎn)生應(yīng)答，增強蛋白翻譯效率和功能三聚體 (NF-YA/YB/YC) 數(shù)量及生物學(xué)功能［2-3］。 本研究對小麥NF-YC 家族成員TaNF-YC1 研究表明，該基因呈典型的干旱和鹽分逆境表達(dá)模式，表現(xiàn)為上述滲透脅迫處理下轉(zhuǎn)錄本數(shù)量增多；逆境誘導(dǎo)增多的該基因轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)正常處理下數(shù)量隨處理進(jìn)程不斷減少。這表明，TaNF-YC1 通過在滲透脅迫下增強表達(dá)，參與植株對滲透脅迫的抵御過程。有關(guān)該基因應(yīng)答滲透脅迫的轉(zhuǎn)錄機制有待進(jìn)一步探討。

NF-YC 蛋白除調(diào)控植株花器官建成、共生真菌侵染宿主和細(xì)胞增殖［18］等生物學(xué)過程外，在介導(dǎo)植株抵御非生物逆境中也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。對模式植物擬南芥NF-YC1 研究表明，該NF-YC 家族成員與下游低溫應(yīng)答基因啟動子順式作用元件結(jié)合，啟動低溫逆境下的基因轉(zhuǎn)錄，增強植株適應(yīng)和抵御低溫逆境的能力［2,12］。本研究利用TaNF-YC1轉(zhuǎn)基因植株，對該基因介導(dǎo)植株抵御滲透脅迫的生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，正、反義表達(dá)該小麥NF-Y 家族基因的煙草植株，抵御干旱和鹽分逆境的能力發(fā)生明顯改變。表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株抵御滲透脅迫的能力顯著增強。因此，TaNF-YC1 在植株抵御滲透脅迫逆境中發(fā)揮正調(diào)控效應(yīng)，該轉(zhuǎn)錄因子基因可作為創(chuàng)制小麥等麥類作物優(yōu)良抗逆品系的重要基因資源。

干旱等滲透脅迫下植株葉片氣孔關(guān)閉速率加快，能有效減少植株水分散失，維持植株體內(nèi)相對良好的水分狀況［19］，進(jìn)而提高干旱等滲透脅迫條件下植株的光合碳同化能力和干物質(zhì)生產(chǎn)力。研究表明，擬南芥中AtNF-YA5 的表達(dá)受到干旱、鹽分和滲透壓力的強烈誘導(dǎo)，AtNF-YA5 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通過ABA依賴型途徑和miR169 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在保衛(wèi)細(xì)胞中，AtNF-YA5 調(diào)節(jié)氣孔孔徑大小，提高干旱耐受性并減少葉片水分缺失；在非保衛(wèi)細(xì)胞中，AtNF-YA5可能通過激活參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因來提高對干旱的耐受性［13］。正義轉(zhuǎn)基因植株 (Sen 1) 隨干旱處理進(jìn)程的持續(xù)氣孔關(guān)閉速率加快，氣孔開度呈逆境下迅速變小特征；與此相反，反義轉(zhuǎn)基因植株 (Anti 1) 隨著上述滲透脅迫處理進(jìn)程，氣孔關(guān)閉速率減慢。與上述結(jié)果相對應(yīng)，隨干旱處理葉片進(jìn)程，Sen 1 失水率較WT 下降，而Anti 1 失水率較WT 提高。這表明，TaNF-YC1 介導(dǎo)植株抵御滲透逆境能力的增強，與其加快氣孔關(guān)閉進(jìn)而改善植株的持水能力有關(guān)。增強的植株持水力進(jìn)一步改善上調(diào)表達(dá)植株的光合碳同化能力、干物質(zhì)生產(chǎn)和植株長勢。擬南芥中報道At-NF-YC2 和At-NF-YB3 首先在細(xì)胞質(zhì)中形成異源二聚體，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與At-NF-YA4相互作用形成異源三聚體。本研究通過對TaNFYC1-GFP 熒光蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的瞬時表達(dá)表明TaNF-YC1-GFP 熒光蛋白位于細(xì)胞核中，這與先前關(guān)于CdtNF-YC1 的報道一致［20］。在大豆中，經(jīng)過NaCl、外源ABA 和PEG 處理，GmNF-YA3 的轉(zhuǎn)錄本升高，過量表達(dá)GmNF-YA3 的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株通過調(diào)控常見的干旱響應(yīng)基因顯示出葉片失水減少和耐旱性增強，并增加了ABA 生物合成（ABA1和ABA2）、ABA 信號傳導(dǎo)（ABI1 和ABI2）和脅迫響應(yīng)（RD29A 和CBF3）基因的表達(dá)［14］。前人研究表明，脫落酸 (ABA) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在介導(dǎo)滲透逆境下ABA 誘發(fā)氣孔運動、改善植株抵御干旱逆境能力中發(fā)揮重要作用［21］。有關(guān)TaNF-YC1 介導(dǎo)滲透逆境下葉片氣孔關(guān)閉特征及其與ABA 信號通路的聯(lián)系有待進(jìn)一步探討。

本研究表明TaNF-YC1 與部分植物種屬NF-YC家族基因具有高度序列一致性特征。該基因呈典型的滲透脅迫逆境表達(dá)模式，編碼蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。上調(diào)表達(dá)TaNF-YC1 顯著增強植株抵御干旱和鹽分逆境的能力，表現(xiàn)為植株長勢增強、干重增加、光合能力提高、干旱處理下氣孔關(guān)閉速率加快，植株失水速率減慢。TaNF-YC1 研究結(jié)果將豐富對小麥抵御滲透脅迫分子機制的認(rèn)識，并為小麥抗旱、耐鹽遺傳改良提供有價值的基因資源和理論依據(jù)。