馬宇馨，杜璇玥，李肖慧，任 瑩，張林旺，邢繼紅,2，張 康,2，董金皋,2

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室，河北 保定 071000；3. 河北省榮軍醫(yī)院，河北 保定 071000）

組蛋白末端的翻譯后修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等［1］。其中，組蛋白的乙?；揎検潜碛^遺傳修飾的重要組成部分，這一過程主要是由組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone deacetylases， HDACs）和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferases，HATs）共同完成的［2］。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶將乙酰輔酶A 中的乙酰基轉(zhuǎn)移到特定的賴氨酸殘基上，中和賴氨酸側(cè)鏈的正電荷，減少與帶負電荷DNA 的親和性，增加側(cè)鏈的疏水體積，破壞氫鍵的形成能力，使核小體構(gòu)象變得松弛，最終促進轉(zhuǎn)錄因子與DNA 分子的結(jié)合，激活特定基因的轉(zhuǎn)錄［2-3］。組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用與此相反，其作用是抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在植物中，賴氨酸乙?；税l(fā)生在組蛋白上，還發(fā)生在細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體等細胞內(nèi)的各種非組蛋白中［3］。

根據(jù)HATs 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，植物HATs 可以分為GNAT 家族（GCN5 相關(guān)的N 端乙酰轉(zhuǎn)移酶）、MYST 家 族（MOZ、Ybf2/Sas3、Sas2、Tip60）、p300/CBP 家族、TAFII250 家族以及核受體共激活因子（SRC-1、ACTR、TIF2）亞家族［4］。根據(jù)HATs 在細胞核內(nèi)的定位和對底物的特異性，又可將其分為A 型和B 型，A 型HATs 主要在細胞核中起作用，B 型HATs 主要在細胞質(zhì)中起作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，HATs 在植物的生長、發(fā)育和脅迫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，擬南芥中AtHACs 蛋白家族參與調(diào)控植株的開花時間，其中AtHAC1 通過乙酰化修飾FLC 的上游因子——自主通路蛋白（FPA），從而影響FLC 所在區(qū)域染色質(zhì)的重塑，進而調(diào)節(jié)FLC 的轉(zhuǎn)錄水平，在擬南芥開花時間調(diào)控過程中發(fā)揮主要作用［6-8］。擬南芥組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5 參與調(diào)控lncRNA AT4 的乙?；胶娃D(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)控擬南芥在缺磷條件下對磷的重新分配［9］。水稻組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5 的抑制表達會引起水稻根冠分生組織的細胞分裂降低，進而影響根的形態(tài)發(fā)育［10］。菜心p300/CBP 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因BrcuHAC1能提高植物應(yīng)對外界環(huán)境變化的能力［11-13］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HATs 大多以復(fù)合物的形式存在，參與轉(zhuǎn)錄激活、基因沉默、細胞周期調(diào)節(jié)、DNA 復(fù)制、修復(fù)和染色體組裝等多種細胞過程［1,14］。此外，HATs 還參與光反應(yīng)過程和乙烯信號途徑［15-16］。

目前，玉米組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HATs 家族的系統(tǒng)研究尚未見報道。本研究利用同源比對的方法，獲得了玉米組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HATs 家族基因；利用生物信息學(xué)方法，對玉米HATs 家族基因進行系統(tǒng)進化分析、保守結(jié)構(gòu)域分析、組織表達特性分析以及生物和非生物脅迫下的表達規(guī)律分析；并利用Real-time PCR 技術(shù)，檢測HATs 家族基因在激素處理后不同時間下的表達規(guī)律，為闡明玉米HATs 家族基因在玉米中的功能及其調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試玉米自交系為B73，來源于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室。

1.2 基因序列數(shù)據(jù)的下載

在玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB（https://www.maizegdb.org，基因組版本：RefGen_v3.27）下載玉米（Zea mays）完整的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)信息，從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR（www.arabidopsis.org）和水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫RGAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/）獲得擬南芥及水稻HATs 家族成員的蛋白質(zhì)序列信息。以玉米所有蛋白序列為庫，利用BLAST 軟件對擬南芥和水稻種的HATs 家族成員進行分析，鑒定玉米HATs 家族成員。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過ClustalX 軟件對擬南芥、水稻和玉米的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族基因的蛋白質(zhì)序列進行多重序列對比，利用MEGA7.0 中的臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 值設(shè)置為1 000。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域分析

利用玉米蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，獲得組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族基因的蛋白質(zhì)序列。通過在線網(wǎng)站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http://pfam.xfam.org）共同確定HATs 家族基因的結(jié)構(gòu)域，并利用IBS1.0.3 工具繪制基因的保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 組織表達特性分析及生物/非生物脅迫下的表達分析

利用從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的SRA 數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)，對玉米HATs 家族基因在不同組織以及生物脅迫和非生物脅迫下的表達譜分析，挖掘玉米HATs 家族基因的表達規(guī)律。

1.6 不同激素處理下的基因表達分析

在玉米生長3周時，用10 mmol/L茉莉酸和10 mmol/L 水楊酸處理玉米幼苗，分別在處理后的0、3、6、12、24 h 取 樣。 利 用Real-time PCR 技 術(shù)，分析玉米HATs 家族基因在茉莉酸和水楊酸處理下的表達情況。Real-time PCR 體系：PCR Mix 7 μL、cDNA 2 μL、引物各0.5 μL，總計10 μL； Real-time PCR 程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30 次。采用比較Ct 值法（2-ΔΔCt法），分析基因的相對表達水平，試驗所用引物見表1。

表1 Real-time PCR 所用引物Table 1 Primers used in Real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米HATs 家族基因的鑒定

從玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB（https://www.maizegdb.org，基因組版本：RefGen_v3.27）獲得玉米HATs 家族基因的位置信息、序列長度及其編碼蛋白的氨基酸；利用在線服務(wù)器ExPASy（http://web.expasy.org/protparam）中的生物信息學(xué)軟件ExPASy-ProtParam tool，對玉米HATs 家族基因所編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點這些理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族基因包含6 個家族成員。從各基因所編碼的蛋白來看，其長度差別較大， 其 中GRMZM2G046021、GRMZM2G044126、GRMZM2G140288 長 度 分 布 在444 ～959 aa，相對分子質(zhì)量相對較??；GRMZM2G470556、GRMZM2G069886、GRMZM2G139977 長度分布在 1 214 ～1 720 aa，相對分子質(zhì)量較大。從預(yù)測的HATs 蛋白的等電點數(shù)據(jù)可以得知，6 個玉米HATs 家族蛋白均呈酸性，且基本在4.8 左右（見表2）。

表2 玉米中的HATs 家族基因信息Table 2 Information of HATs family genes in maize

2.2 玉米HATs 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了明確玉米HATs 家族成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，試驗將擬南芥、水稻中已經(jīng)鑒定的HATs 家族成員的蛋白質(zhì)序列進行多序列比對，并分別以擬南芥的HATs 家族基因的亞分類為標準，利用MEGA7.0軟件，選取臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族成員可以被分為3 個亞家族，分別為MYST、GANT 和CBP 亞家族。其中，CBP 亞家族中包含GRMZM2G139977、GRMZM2G470556和GRMZM2G069886，GANT 亞 家 族 中 包 含GRMZM2G044126 和GRMZM2G140288，MYST亞家族包含GRMZM2G046021（圖1）。

圖1 擬南芥、水稻和玉米組蛋白乙?；福℉ATs） 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree analysis of histone acetyltransferases (HATs) in Arabidopsis, rice and maize

2.3 玉米HATs 家族基因的保守結(jié)構(gòu)域分析

通過SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http://pfam.xfam.org）數(shù)據(jù)庫對玉米的HATs 家族基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行分析，然后利用IBS1.0.3 工具對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行繪制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族蛋白均包含多個保守的結(jié)構(gòu)域，且同一亞家族的蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域高度相似。其中，CBP 亞家族GRMZM2G139977、GRMZM2G470556 和GRMZM2G069886 蛋 白 均 包含ZnF_TAZ 和KAT11 保守結(jié)構(gòu)域，GANT 亞家族的GRMZM2G044126 和GRMZM2G140288 均 包 含CHROMO 和ZnF_C2H2 保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 玉米組蛋白乙酰化酶家族成員的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conserved domain analysis of HATs family proteins in maize

2.4 玉米HATs 家族基因的組織表達特性分析

使用SRA 數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對玉米HATs 家族基因的組織表達特異進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族基因的表達模式可分為2 個簇。第一簇包括GRMZM2G046021 和GRMZM2G044126，GRMZM2G046021 在莖尖分生組織、初始發(fā)育的小穗和胚中表達較高，GRMZM2G044126 在初始發(fā)育的小穗和胚中表達較高，在葉、種子和莖尖分生組織中表達水平低于GRMZM2G046021。第二簇所包含的4 個基因在花粉中的表達水平明顯低于第一簇的基因，其中，GRMZM2G140288 在葉尖和苗期葉子中表達水平較高，與另外3 個基因相比具有明顯的組織特異性（見圖3）。

圖3 玉米HATs 家族基因在不同組織中的表達譜 Fig.3 The expression pattern of maize HATs family genes in maize different tissues

2.5 玉米HATs 家族基因在生物和非生物脅迫下的表達分析

對玉米HATs 家族基因在高溫、低溫、鹽、紫外線和干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族基因在不同非生物脅迫下呈現(xiàn)出不同的表達規(guī)律（圖4）。其中，高溫脅迫下，GRMZM2G046021 上調(diào)表達，其余基因均下調(diào)表達；低溫脅迫下，GRMZM2G470556 上調(diào)表達，其余基因均下調(diào)表達；鹽脅迫下，GRMZM2G046021、GRMZM2G044126 上調(diào)表達，其余基因均下調(diào)表達；紫外線脅迫下，所有基因均下調(diào)表達；干旱脅迫下，GRMZM2G140288 下調(diào)表達，其余基因均上調(diào)表達。推測，玉米HATs 家族基因可能通過調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化水平參與玉米對非生物脅迫的響應(yīng)。

圖4 玉米HATs 家族基因在熱、冷、鹽、紫外線 和干旱脅迫下的表達模式 Fig.4 The expression pattern of HATs family genes under heat, cold, salt, UV and drought stress

對玉米HATs 家族基因在擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒過程中的表達規(guī)律進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米HATs 家族基因在病菌侵染的4 和12 h 呈現(xiàn)較高的表達水平，但在病菌侵染的24、48 和72 h 呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達趨勢，其中GRMZM2G044126 和GRMZM2G140288 在病菌侵染的整個過程中始終處于較高的表達水平；GRMZM2G470556 在病菌侵染的整個過程中始終處于較低表達水平，且在病菌侵染的24、48 和72 h 不表達。推測，玉米HATs 家族基因通過調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化水平參與玉米對生物脅迫的響應(yīng)。

圖5 玉米HATs 家族基因在擬輪枝鐮孢 侵染玉米籽粒后的表達模式 Fig.5 The expression pattern of HATs family genes with Fusarium verticillioides infection in maize kernel

2.6 玉米HATs 家族基因在不同激素處理下的表達分析

利用MeJA（茉莉酸）和SA（水楊酸）對3 周的玉米幼苗進行處理，在不同時間點（0、3、6、12、24 h）取樣，檢測玉米HATs 家族基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在茉莉酸處理中，玉米HATs 家族大多數(shù)基因在處理3 h 表達水平呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢，處理6 h 有短暫的上升，在處理12、24 h 表達水平又開始下降，最終維持在較低水平。GRMZM2G046021 在茉莉酸處理3 h 呈現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)表達，在處理6 h 后表達水平呈現(xiàn)明顯下降趨勢，與該家族中其他基因的表達規(guī)律明顯不同（圖6）。

圖6 經(jīng)茉莉酸處理后玉米HATs 家族基因的表達分析Fig.6 Expression level of HATs family genes with jasmonic acid treatment in maize

在水楊酸處理中，玉米HATs 家族基因基本上在處理3 h 表達水平呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢，在6、12 h 表達水平略有恢復(fù)，最終在24 h 又降低到較低水平。其中，GRMZM2G140288 在水楊酸處理3 h 后表達水平明顯下調(diào)，在處理12 h 表達水平有短暫的上調(diào)，在處理24 h 表達水平最低（圖7）。

圖7 經(jīng)水楊酸處理后玉米HATs 家族表達量Fig.7 Expression level of HATs family genes with salicylic acid treatment in maize

3 討論與結(jié)論

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）是一類在核心組蛋白（H2A、H2B、H3 和H4）中添加乙?；拿福?6］，從而調(diào)節(jié)基因表達和基因組的穩(wěn)定性，在植物生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［17］。擬南芥、水稻HATs 家族基因的研究較為深入，已明確了其HATs 家族基因的成員、系統(tǒng)進化關(guān)系以及部分基因在植物生長發(fā)育及其響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中的作用。但是，玉米HATs 家族基因的系統(tǒng)研究至今尚未見報道。本研究對玉米基因組進行了系統(tǒng)的分析，鑒定出6 個玉米HATs 家族基因，系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為MYST、GANT 和CBP 共3個亞家族，并發(fā)現(xiàn)玉米HATs 基因家族與擬南芥和水稻HATs 家族基因在各個亞家族的數(shù)量分布是類似的，且玉米HATs 家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和排列在同一亞族中相對保守。資料顯示，GANT亞家族含有GCN5 相關(guān)的N 端乙酰轉(zhuǎn)移酶，GCN5是Spt-Ada-Gcn5（SAGA）乙酰轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)錄適配器ADA 的催化亞基［18］。在擬南芥中，GCN5 和ADA2 能夠參與對極端溫度的響應(yīng)［17］，GCN5 突變后會導(dǎo)致植物形態(tài)的多種突變［19］。MYST 亞家族一般含有MOZ、Ybf2/Sas3、Sas2、Tip60 等保守結(jié)構(gòu)域［20］，在酵母、人和果蠅中的研究相對較多，主要作為發(fā)育調(diào)節(jié)劑其作用［21］。CBP 亞家族參與調(diào)控細胞的生殖和生長發(fā)育過程［22］。本研究中，MYST、GANT 和CBP 亞家族中各玉米HATs 家族基因的功能還需要進一步的深入研究予以鑒定。

本研究中，玉米HATs 家族基因在不同組織和響應(yīng)生物/非生物脅迫過程中的表達水平呈現(xiàn)出明顯的差異，推測玉米HATs 家族基因在玉米生長發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫過程發(fā)揮重要的作用。其中，玉米CBP 亞家族包含的3 個組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在花粉中變化明顯，所以推測它們與植物的生殖生長有關(guān)；GRMZM2G044126 和GRMZM2G140288在擬輪枝鐮孢侵染玉米籽粒過程中始終處于較高的表達水平，且在病菌侵染的24、48 和72 h 后呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達趨勢，推測其與玉米響應(yīng)病菌侵染過程密切相關(guān)。此外，本研究用茉莉酸和水楊酸處理玉米幼苗，發(fā)現(xiàn)了玉米HATs 家族基因在茉莉酸和水楊酸處理后表現(xiàn)出不同的表達規(guī)律，推測玉米HATs 家族基因可能參與了茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)。研究結(jié)果為闡明玉米HATs 家族基因的功能及其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。