陳現(xiàn)朝，張立平，秦志列，廖祥政，孫 輝，張風廷，趙昌平

（北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心/雜交小麥分子遺傳北京市重點實驗室，北京 100097）

基于小麥光溫敏不育系建立的二系雜交小麥技術(shù)，已成為小麥雜種優(yōu)勢利用的主要途徑。由于二系雜交小麥親本材料來源廣泛，需要對材料的光溫敏的特性進行田間鑒定和評價工作，以獲得生產(chǎn)應(yīng)用價值更高的骨干親本。小麥光溫敏特性主要由光周期、春化、開花期基因控制，此外光溫特性和株高往往決定小麥品種適于種植的生態(tài)區(qū)?？刂乒庵芷谔匦缘幕虬≒pd-D1 (Ppd1)、Ppd-B1 (Ppd2) 和Ppd-A1 (Ppd3)，分別位于染色體2D、2B 和2A。Beals 等根據(jù)大麥Ppd-H1 基因，同源克隆到小麥Ppd 基因并開發(fā)了Ppd-D1 的功能標記［1］，該標記已用于青海和西藏小麥品種等位變異檢測［2］。春化基因決定生長習性，影響開花時間。依據(jù)通過春化階段所需的溫度和時間將小麥劃分為冬性和春性。研究發(fā)現(xiàn)控制小麥春化特性的基因有Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、Vrn-B3、Vrn-D3 和Vrn-D4，分別位于5A、5B、5D、6B、7D 和5D 上，其中Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1 和Vrn-B3 已被克?。?-5］，開發(fā)的功能標記已用于小麥品種檢測［6-7］。世界上已發(fā)現(xiàn)的Rht (Reduced height)矮稈基因有24 個, 但在推廣小麥品種中包含的Rht 基因主要是Rht-1B、Rht-1D、Rht8［8］，其中Rht-1B、Rht-1D 開發(fā)了功能標記并用于小麥品種檢測［9］。

光周期、春化和株高等性狀的田間鑒定受環(huán)境因素影響較大。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，由LGC 公司研發(fā)的競爭性等位基因特異性PCR 技術(shù)具有高度穩(wěn)定性、準確性和低成本優(yōu)勢，逐漸被用于重要功能基因的SNP (Single nucleotide polymorphism, SNP) 和InDels (Insertion-deletion, InDels)檢測［10］。本團隊前期研究表明，雙親為地理遠緣、生態(tài)遠緣時，二系雜交小麥的增產(chǎn)優(yōu)勢最為顯著［11］。但是目前主要通過多年多點的田間表型測定來鑒定二系雜交小麥育種親本的光溫生態(tài)及株高特性，對于其基因組成和分布等研究仍是空白，這已成為限制雜交小麥親本選育、組合配置以及組合篩選效率提高的重要瓶頸。本研究利用光周期、春化和矮稈性狀的6 對KASP 功能標記，對245 份二系雜交小麥親本材料進行檢測，分析上述基因的等位變異類型和分布頻率，初步了解雜交小麥親本材料中光溫生態(tài)及株高性狀的基因等位變異信息，為進一步開展二系雜交小麥分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以245 份二系雜交小麥親本為供試材料，其中恢復(fù)系233 份，不育系12 份，于2017—2018 年度種植于鄧州雜交小麥產(chǎn)業(yè)化基地（北緯N32°40′7.41″ 東經(jīng)E112°08′54.46″）。

1.2 KASP 標記引物設(shè)計

參照Rasheed A 研究結(jié)果［12］設(shè)計本研究所需的6 對KASP 標記引物，根據(jù)KASP 技術(shù)的引物設(shè)計要求，F(xiàn)AM 引物和HEX 引物5′端分別含有特異性接頭，GAAGGTGACCAAGTTCATGCT和GAAGGTCGGAGTCAACGGATT， 可 與 熒光標記結(jié)合用于熒光檢測。具體引物序列信息如 表1 所示。

1.3 DNA 提取

小麥返青期，田間剪取供試恢復(fù)系和不育系葉片。利用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）分別提取245 份供試小麥材料基因組DNA，供試基因組DNA 在10 ～30 ng/μL。紫外分光光度計Nanodrop2000（Thermo）檢測A260/A280比值在1.8 左右，A260/A230比值大于1.8。

表1 試驗所需引物Table 1 Primers in the test

1.4 KASP 標記檢測及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

供試小麥材料基因組DNA 為模板，分別采用6 對引物進行PCR 擴增，得到PCR 擴增產(chǎn)物。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性，15 min；94 ℃變性20 s，61 ～55 ℃（選用Touch down 程序，每循環(huán)降低0.6 ℃） 1 min，擴增10 個循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃延伸1 min，繼續(xù)擴增26 個循環(huán)。待PCR 擴增產(chǎn)物溫度降至40 ℃以下時通過酶標儀FAM、HEX 光束掃描讀取熒光值，并做基因型分析。試驗結(jié)果剔除基因型雜合和缺失樣本，用Excel 統(tǒng)計恢復(fù)系和不育系材料中不同基因型的頻率并計算基因型的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP 標記分型

選擇光周期、春化和矮稈性狀的6 對KASP 功能標記，對245 份二系雜交小麥親本材料進行鑒定。KASP 標記對上述基因進行分型，其中光周期基因Ppd-B1、春化基因Vrn-A1 和矮稈基因Rht-D1 的KASP 分型效果如圖1 所示。

圖1 KASP 標記在供試材料光周期Ppd-B1（A）、春化Vrn-A1（B）和矮稈Rht-D1（C）基因分型效果Fig. 1 Result of the tested materials by selected KASP assays of photoperiod gene Ppd-B1 (A), vernalization gene Vrn-A1 (B) and dwarf gene Rht-D1 (C)

2.2 光周期基因、春化基因和矮稈基因組成

本研究檢測的光周期基因有Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1（表2）。檢測結(jié)果顯示二系雜交小麥親本主要以光周期敏感的類型為主。在245 份供試材料中均發(fā)現(xiàn)光周期敏感基因型Ppd-A1b、Ppd-D1b，216 份材料中檢測到光周期敏感基因型Ppd-B1b；只有29 份材料含有光周期不敏感基因型Ppd-B1a，其中恢復(fù)系28 份，不育系1 份，其比率分別為12.02%和8.33%。

本研究檢測的春化基因為Vrn-A1，檢測結(jié)果顯示二系雜交小麥親本主要以冬性為主。242 份材料含有冬性基因型vrn-A1，占全部供試材料的98.78%，其中恢復(fù)系230 份，不育系12 份；其比率分別為98.71%和100%。只有3 份恢復(fù)系材料含有春性基因型Vrn-A1，其比率為1.29%（見表2）。

本研究檢測小麥矮稈基因為Rht-B1 和Rht-D1。檢測結(jié)果顯示96.73%的材料含有Rht-B1a基因型，其中恢復(fù)系229 份，不育系8 份；在恢復(fù)系和不育系的比率分別98.28%和66.67%。89.8%的材料含有Rht-D1a 基因型，其中恢復(fù)系220 份，其比率為94.42%；10.2%的材料含有Rht-D1b 基因型，其中恢復(fù)系13 份，不育系12 份；在恢復(fù)系和不育系的比率分別5.58%和100%（見表2）。

表2 光周期、春化和矮稈等位基因類型及頻率Table 2 Allelic gene type and frequency of photoperiod, vernalization and dwarf genes

2.3 恢復(fù)系和不育系基因型及頻率

檢測結(jié)果表明，供試材料中光周期和春化基因型Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1b 和vrnA1a 占 主 導(dǎo)地位，在恢復(fù)系的比率分別91.67%和98.71%，在不育系的比率分別87.98%和100%。這表明二系雜交小麥親本主要為光周期敏感和冬性類型材料。

檢測結(jié)果表明，不育系中矮稈基因型Rht-D1b+Rht-B1a-160 bp 和Rht-D1b+Rht-B1a 比 例 為1∶2?；謴?fù)系中矮稈基因型Rht-D1a+Rht-B1a 高達92.70%。這表明供試恢復(fù)系和不育系材料中矮稈基因型存在明顯的差異。

表3 恢復(fù)系和不育系基因型數(shù)量和頻率Table 3 Number and frequency of gene type in restorer lines and sterile lines

3 討論

3.1 光周期和春化基因型、光溫特性和地域分布的關(guān)系

光周期基因型可以反映品種的光周期特性。研究表明光周期基因Ppd-A1、Ppd-B1 和Ppd-D1 是調(diào)控小麥光周期敏感性的重要遺傳因素之一，對光周期不敏感作用強弱順序分別為Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1［1,13］。此外，Ppd-D1a 等位基因檢測可以作為小麥品種光周期的鑒定方法［14］。在不同的種植區(qū)選擇適宜的小麥品種，可以充分利用光照資源，能夠最大限度發(fā)揮品種的潛力，從而提高產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)在二系雜交小麥親本中，88%的不育系和91.7%的恢復(fù)系是光周期敏感型Ppd-A1b+Ppd-B1b+Ppd-D1b。這可能與選育或篩選出的親本材料地處北部冬麥區(qū)有關(guān)，光周期敏感型基因有利于推遲小麥拔節(jié)，防止小麥過早形成花器官，避免遭受早春霜凍的傷害。

控制小麥春化特性的基因有Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、Vrn-B3、Vrn-D3 和Vrn-D。Vrn-A1 的春化作用最強，且對Vrn-B1 和Vrn-D1 有上位性效應(yīng)［15］。由于Vrn-1 基因分為顯性和隱性兩種類型，顯性基因?qū)?yīng)春性，隱性基因?qū)?yīng)冬性［16］。本研究發(fā)現(xiàn)供試材料中98.7%的恢復(fù)系和全部不育系含有vrn-A1，1.3%的恢復(fù)系含有Vrn-A1，說明二系雜交小麥大部分恢復(fù)系和不育系是含vrn-A1 基因型為主的材料。由于本研究尚未檢測春化基因有Vrn-B1、Vrn-D1、Vrn-B3，二系雜交小麥親本中是否含有其他春化基因類型有待進一步檢測。

3.2 矮稈基因型和株高的關(guān)系

Rht 基因具有降低小麥植株高度，增強小麥抗倒伏能力，甚至增加小麥糧食收獲指數(shù)的功能，但是不同的Rht 基因具有不同的特征，對于小麥的影響也各不相同［8］。攜帶Rht1（Rht-B1b）植株的平均高度大約是69.9 cm，降稈24%，Rht2（Rht-D1b）植株的平均高度大約是67.9 cm，降稈24%，當Rht1 和Rht2 矮稈基因共同作用時株高降稈60%［17］。本研究發(fā)現(xiàn)二系雜交小麥骨干不育系利用的主要攜帶矮稈基因Rht-D1b，占不育系材料的100%，二系雜交小麥不育系材料平均株高67 cm（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。在恢復(fù)系中主要攜帶矮稈野生型基因Rht-B1a，均株高92 cm（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。上述結(jié)果可能是二系雜交小麥親本定向選擇形成的。由于目前還未開發(fā)出Rht8 基因的KASP 功能標記，因此本研究尚未對Rht8 基因進行檢測。

3.3 KASP 標記鑒定雜交小麥親本的科學(xué)意義

小麥光周期不敏感品種，長日照和短日照條件下均可正常開花，其種植適宜區(qū)域廣［14］。而本團隊多年的研究發(fā)現(xiàn)，冬春雜交選育出雜交小麥品種，具有較廣泛的生態(tài)適應(yīng)性，其種植適宜區(qū)域較廣［11］，本研究發(fā)現(xiàn)，雜交小麥親本主要集中于光周期敏感和冬性基因型，不利于篩選出光周期不敏感組合，因此今后在種質(zhì)資源引進和利用方面，需要增加光周期不敏感型材料，而且進一步發(fā)展冬春雜交組合配置模式，以增強二系雜交小麥的生態(tài)適應(yīng)性。此外，需要進一步在親本株高性狀的選育中，聚合降稈作用較強的基因，同時考慮攜帶不同株高基因的不育系和恢復(fù)系配制的雜交組合的性狀表現(xiàn)，以期將二系雜交小麥株高控制在更合理的范圍。

本研究結(jié)果表明可利用KASP 功能標記對二系雜交小麥親本光周期、春化和矮稈基因的基因型進行檢測，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀調(diào)查，從而建立二系雜交小麥生態(tài)適應(yīng)性評價體系。這為鑒定并篩選優(yōu)異基因型材料，并充分利用優(yōu)異種質(zhì)資源，豐富二系雜交小麥親本的遺傳基礎(chǔ)，以及創(chuàng)制強優(yōu)勢、廣適性雜交小麥組合提供重要支撐。本研究進一步驗證了KASP 標記可以作為一種重要的分子育種手段，提高二系雜交小麥育種效率。