周 帆，米淑玲，張曉燕，藏金萍，張 康，邢繼紅，董金皋

（1. 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000； 2. 河北省滄州市運(yùn)河區(qū)農(nóng)業(yè)局，河北 滄州 061000）

BASIC PENTACYSTEINE（BPC）基因家族是植物特異性的轉(zhuǎn)錄因子家族，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。擬南芥有7 個(gè)BPC 基因，分為BPC1-BPC3、BPC4-BPC6 和BPC7 3 種類(lèi)型。除了BPC5 被認(rèn)為是假基因外，其他6 個(gè)BPC 基因均是編碼轉(zhuǎn)錄的激活因子或阻遏因子［1-2］，與3 000多個(gè)包含GAGA 重復(fù)序列的基因結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，BPC 家族基因存在功能冗余，單個(gè)的bpc 基因突變表型不明顯，但多個(gè)bpc 基因同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致明顯的發(fā)育缺陷［1-2］。BPC 可與Polycomb-Repressive Complex 1（PRC1）蛋白相互作用形成蛋白復(fù)合物，通過(guò)修飾組蛋白的尾部抑制基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而進(jìn)行染色質(zhì)的重塑［3-4］。此外，BPC6 與PRC1 復(fù)合體的成員LHP1 相互作用，將LHP1 招募至GAGA結(jié)合基序上，并且顯示PRC2 成員Vernalization 2（VRN2）在體內(nèi)通過(guò)LHP1 與BPC6 關(guān)聯(lián)［5］，也能通過(guò)PRC1/2 復(fù)合物獨(dú)立機(jī)制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［5-6］。

BPC 的功能并非對(duì)一種發(fā)育過(guò)程或組織具有特異性。BPC 是胚珠發(fā)育基因INNER NO OUTER （INO）的調(diào)節(jié)因子［1］，同時(shí)也參與種子的發(fā)育，是B3 結(jié)構(gòu)域LEAFY COTYLEDON LEC2（LEC2）基因的調(diào)節(jié)因子［7］。此外，體外試驗(yàn)表明BPC1 的結(jié)合導(dǎo)致STK 啟動(dòng)子區(qū)的DNA 彎曲，這可能是由于BPC1 在STK 啟動(dòng)子中寡聚并結(jié)合多個(gè)GA 片段的能力所促進(jìn)的［6,8］。

玉米中轉(zhuǎn)錄因子家族眾多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，Plant Transcription Factor Database（Plant TFDB）數(shù)據(jù)庫(kù)顯示玉米中共含有3 376 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別隸屬于56 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族［9］。其中大部分轉(zhuǎn)錄因子的研究都已取得進(jìn)展，而玉米BPC 家族的研究還未及深入。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)玉米BPC 家族基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、組織表達(dá)特性以及在玉米抵抗非生物脅迫過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律分析；利用Real-time PCR 技術(shù)，檢測(cè)玉米BPC 家族基因在不同激素處理后的表達(dá)水平，為闡明玉米BPC 家族基因的功能及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米自交系‘鄭單958’，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供和保存。

1.2 玉米BPC 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

從Plant TFDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥、水稻、高粱、玉米的BPC 蛋白序列，利用MEGA 7.0 構(gòu)建BPC 基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)［2］，比對(duì)方法選取鄰接法，bootstrap 值設(shè)為1 000。

1.3 玉米BPC 家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

從玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）中查詢(xún)得到玉米BPC 家族中各基因的分析圖，對(duì)比分析玉米BPC 家族基因的相關(guān)信息。

1.4 玉米BPC 家族基因的結(jié)構(gòu)域分析

利用已知的玉米BPC 基因序列，使用Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)工具對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，獲得玉米BPC 家族基因的結(jié)構(gòu)域分析圖。

1.5 玉米BPC 家族基因的組織特異性表達(dá)分析

從玉米基因數(shù)據(jù)庫(kù)MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）中下載玉米BPC 家族基因各自的gene model 表達(dá)圖譜，其中MaizeGDB 數(shù)據(jù)庫(kù)使用高密度NimbleGen 微陣列［10］和RNA 測(cè)序［11］可確定玉米BPC 家族的組織特異性表達(dá)情況，從eFP 瀏覽器可獲得NimbleGen 陣列數(shù)據(jù)的表達(dá)圖像［12］，蛋白質(zhì)在組織中不同的表達(dá)程度用不同的顏色表示，黃色表達(dá)程度低，紅色表達(dá)程度高，黃色到紅色表示蛋白在組織中表達(dá)量逐漸增高。

1.6 玉米BPC 家族基因在不同脅迫處理下的表達(dá)分析

從玉米數(shù)據(jù)公共平臺(tái)上獲得14 日齡的B73 玉米幼苗中玉米BPC 家族在熱脅迫（50 ℃處理4 h）、冷脅迫（5 ℃處理4 h）、鹽脅迫（300 mmol/L NaCl 浸泡20 h）、紫外線(xiàn)脅迫（2 h）和干旱脅迫（幼苗置于濾紙上4 h）處理下的數(shù)據(jù)，通過(guò)Heml 軟件制作熱圖并分析。

1.7 玉米BPC 家族基因在不同激素處理下的表達(dá)分析

選取14 日齡的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且一致的玉米自交系鄭單958 幼苗，分別進(jìn)行水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ACC）處理，并于處理后的0、12、24 h 截取玉米幼莖，并用液氮速凍，試驗(yàn)重復(fù)3 次。利用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒，提取玉米幼莖的總RNA，使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒，進(jìn)行玉米cDNA 的合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，使用玉米BPC 家族基因的特異性引物（表1），進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)玉米BPC 家族基因的表達(dá)水平，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 試驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米BPC 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了闡明玉米BPC 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究從Plant TFDB 中獲取了7 個(gè)擬南芥、4 個(gè)水稻、5 個(gè)高粱和4 個(gè)玉米的BPC 家族蛋白的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過(guò)MEGA 7.0 使用鄰接法對(duì)比得出BPC 蛋白序列進(jìn)化樹(shù)（圖1）。進(jìn)化樹(shù)形成3 個(gè)親緣關(guān)系較近的分支，分別命名I、II、III；分支I 包含GRMZM2G118690、Sobic.010G021200、LOC_Os06g04010、AT5G42520、AT4G38910、AT2G21240，分支II 包含AT2G35550，分支III 包含AT2G01930、AT1G14685、AT1G68120、LOC_Os10g02620、LOC_Os10g02509、LOC_Os10g02584、GRMZM2G164735、GRMZM2G166230、GRMZM2G179366、Sobic.002G114000、Sobic.002G114200、Sobic.002G114400、Sobic.010G056000。其 中，4 個(gè)玉米的BPC 家族蛋白中，GRMZM2G118690 屬于分 支I，GRMZM2G164735、GRMZM2G166230、GRMZM2G179366 親緣關(guān)系較近，均屬于分支III 中。

圖1 玉米BPC 家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of BPC family proteins in maize

2.2 玉米BPC 家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)玉米BPC 家族基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米BPC 家族基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量及其分布存在明顯的差異。其中，在GRMZM2G118690的3 種轉(zhuǎn)錄本T01、T02、T03 中都含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子，3 個(gè)轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)長(zhǎng)度一致；GRMZM2G164735 和GRMZM2G166230 的2 種 轉(zhuǎn) 錄本T01、T02 中均無(wú)內(nèi)含子，且2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)長(zhǎng)度一致；GRMZM2G179366 的轉(zhuǎn)錄本T01 中含4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，T02 中只含有1 個(gè)外顯子，T01 編碼區(qū)的長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于T02（圖2）。以?xún)?nèi)含子的數(shù)量為參考依據(jù)，可將玉米BPC 基因分為三類(lèi)：GRMZM2G179366-T01 含 有3 個(gè) 內(nèi) 含 子，為I 類(lèi) 基因；GRMZM2G118690 的3 種轉(zhuǎn)錄本T01、T02、T03都含有1 個(gè)內(nèi)含子，為II 類(lèi)基因；III 類(lèi)沒(méi)有內(nèi)含子，包 括GRMZM2G164735 和GRMZM2G166230 的2 種轉(zhuǎn)錄本T01、T02 以及GRMZM2G179366-T02。從基因長(zhǎng)度上比較，GRMZM2G179366-T01 的序列最長(zhǎng)，其次是GRMZM2G118690 的3 種轉(zhuǎn)錄本和GRMZM2G164735 的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，GRMZM2G166230的2 種轉(zhuǎn)錄本的序列最短。

圖 2 玉米BPC 家族基因的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of BPC family genes in maize

2.3 玉米BPC 家族基因的結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)玉米BPC 家族基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米BPC 家族基因均包含有保守的GAGA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GAGA_bind），但保守結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度存在明顯差別（圖3）。其中，GRMZM2G118690 的3種轉(zhuǎn)錄本T01、T02、T03 均含有一段由330 個(gè)氨基酸組成的GAGA_bind 結(jié)構(gòu)域，GRMZM2G164735的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本T01、T02 均含有348 個(gè)氨基酸組成的GAGA_bind 結(jié) 構(gòu) 域，GRMZM2G166230 的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本T01、T02 含有184 個(gè)氨基酸組成的GAGA_bind 結(jié)構(gòu)域，GRMZM2G179366 的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本T01和T02 的保守結(jié)構(gòu)域GAGA_bind 由350 個(gè)氨基酸組成。GAGA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域在GRMZM2G118690、GRMZM2G164735 和GRMZM2G179366 中所占長(zhǎng)度比例基本一致，GRMZM2G179366 中GAGA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域所占長(zhǎng)度比例最短。

圖 3 玉米BPC 家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domain of the BPC family proteins in maize

2.4 玉米BPC 家族基因的組織特異性表達(dá)分析

從MaizeGDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得玉米BPC 家族基因的組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)玉米BPC 家族基因呈現(xiàn)出相同的分布和表達(dá)模式（見(jiàn)圖4）。

圖4 玉米BPC 家族基因的組織表達(dá)特性Fig.4 Tissue-specific expression profile of BPC family genes in maize

在玉米未成熟階段，BPC 家族的4 種蛋白GRM ZM2G118690、GRMZM2G164735、GRMZM2G 166230 和GRMZM2G179366 均在莖尖、未成熟的雄穗、葉片的葉尖、葉基以及未成熟的穗軸中的表達(dá)量較高，這些部位都含有大量的分生組織，雄穗中則含有大量減數(shù)分裂產(chǎn)生的雄配子，因此推測(cè)BPC 蛋白可能與細(xì)胞的有絲分裂與減數(shù)分裂有關(guān)。在成熟玉米中，BPC 家族蛋白在玉米種子的胚、胚乳和種皮中表達(dá)量較高。植物的胚與植物的遺傳息息相關(guān)，胚乳則為種子的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，因此BPC家族可能在種子發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。

2.5 玉米BPC 家族基因在脅迫處理下的表達(dá)水平

對(duì)玉米BPC 家族基因在熱脅迫、冷脅迫、鹽脅迫、紫外線(xiàn)脅迫和干旱脅迫處理下的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱脅迫下，GRMZM2G118690、G R M Z M 2 G 1 6 4 7 3 5、G R M Z M 2 G 1 6 6 2 3 0、GRMZM2G179366 的表達(dá)量均明顯的降低，其中GRMZM2G166230 在玉米中的表達(dá)量最低，其次是GRMZM2G164735。冷脅迫下，4 個(gè)基因的表達(dá)量均有一定程度的下降，其中GRMZM2G164735 下降的幅度最小，GRMZM2G166230 下降程度最為明顯。鹽脅迫下，GRMZM2G164735、GRMZM2G166230和GRMZM2G179366 的 表 達(dá) 明 顯 下 調(diào)，GRMZM2G118690 的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。紫外線(xiàn) 脅 迫 下，GRMZM2G118690、GRMZM2G166230和GRMZM2G179366 的表達(dá)量受到明顯的抑制，GRMZM2G164735 的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。干旱脅迫下，GRMZM2G166230 的表達(dá)量受到明顯的抑制，其它3 個(gè)基因的表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化（圖5）。因此推測(cè)BPC 家族基因參與玉米對(duì)熱脅迫、冷脅迫、鹽脅迫、紫外線(xiàn)脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

圖5 玉米BPC 家族基因在脅迫處理下的表達(dá)Fig.5 Expression levels of BPC family genes in maize under stresses

2.6 玉米BPC 家族基因在激素處理后的表達(dá)水平

水楊酸、茉莉酸、乙烯利處理14 日齡的玉米自交系鄭單958幼苗，對(duì)玉米BPC家族基因GRMZM2G118690、 GRMZM2G164735、GRMZM2G166230、GRMZM2G179366 的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)（見(jiàn)圖6）。

圖6 SA、JA 和ACC 處理下玉米BPC 家族基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of BPC family genes in maize treated with SA, JA and ACC

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G118690 在水楊酸、茉莉酸、乙烯利處理12 h 后，表達(dá)量均明顯下降，處理24 h 后，在水楊酸和茉莉酸處理的玉米樣品中表達(dá)量則出現(xiàn)增高，在茉莉酸處理下，增幅更為明顯。GRMZM2G164735 在水楊酸、茉莉酸、乙烯利處理的樣品中，在處理后的12 h 和24 h 表達(dá)量均增高，在乙烯利處理24 h 內(nèi)玉米樣品中的表達(dá)量最高。GRMZM2G166230 表達(dá)量在水楊酸處理后24 h 內(nèi)持續(xù)增高；茉莉酸處理后，GRMZM2G166230 的表達(dá)量在處理24 h 內(nèi)有所下降，其中處理的前12 h 內(nèi)，下降趨勢(shì)最為明顯。GRMZM2G179366 在乙烯利處理的樣品中，表達(dá)量變化明顯上升，而水楊酸和茉莉酸處理后，GRMZM2G179366 的表達(dá)量則顯示出下降的趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

BPC 家族基因參與調(diào)控植物的多種生理過(guò) 程［1-2］，盡管BPC 家族是研究時(shí)間較短的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族［13］，但目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其可以充當(dāng)基因表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用［1,6,8,13］。在真核生物中，多種轉(zhuǎn)錄因子通常共同作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)［14-16］。鑒于BPC 調(diào)控多種發(fā)育過(guò)程，它們很可能依賴(lài)于其他轉(zhuǎn)錄因子的共同作用調(diào)控靶基因的特異性表達(dá)。BPC6 蛋白的靶基因與響應(yīng)細(xì)胞分裂素而富集的B 型ARR10 的靶基因之間存在明顯的重疊［17］。另外，BPC 可能與B 型ARR 和/或CRF共同作用，以響應(yīng)細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)特定基因［17-19］。ARR10 可與BPC1 和BPC2 的啟動(dòng)子結(jié)合，并且BPC1 響應(yīng)細(xì)胞分裂素而被誘導(dǎo)，因此BPC 和B 型ARR 之間可能存在正反饋回路。

本研究發(fā)現(xiàn)，玉米BPC 家族蛋白與水稻的BPC家族蛋白的親緣關(guān)系更為密切，因此，以水稻的同源轉(zhuǎn)錄因子為參照，進(jìn)行玉米BPC 家族基因的研究，分析進(jìn)化過(guò)程中的變異，推測(cè)玉米的物種起源或進(jìn)化途徑。同時(shí)基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域與基因的功能有著緊密的聯(lián)系，以水稻和玉米的親緣關(guān)系為基礎(chǔ)，以基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析為輔助，可以更直接地對(duì)玉米BPC 家族基因進(jìn)行功能分析。

研究表明，BPC 調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基因的一個(gè)子集［18］，這與BPC 家族蛋白的分布相一致。從MaizeGDB 中得到的玉米BPC 家族在不同組織當(dāng)中表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)：4 種BPC 蛋白均在莖尖、穗尖和未成熟玉米籽粒中的表達(dá)量較高，推測(cè)其功能可能與細(xì)胞分裂和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。非生物脅迫中，GRMAM2G179366 在熱處理、冷處理、鹽處理、紫外線(xiàn)處理中，表達(dá)量均有明顯的降低趨勢(shì)，推測(cè)其參與植物抵抗逆境的過(guò)程。水楊酸、茉莉酸和乙烯利處理后，4 種基因表達(dá)量的不同變化表明，玉米BPC 家族的不同基因可能參與不同激素介導(dǎo)的免疫過(guò)程。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，對(duì)玉米BPC 家族進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、組織表達(dá)特異性、非生物脅迫及激素處理下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，推測(cè)玉米BPC家族可能與有絲分裂、減數(shù)分裂、種子發(fā)育以及植物體抗病抗逆過(guò)程有關(guān)，為玉米BPC 家族基因的功能及其調(diào)控機(jī)制的研究指明了方向。