崔鐘池，武文月，王婉晴，胡鐵猛，王海燕，劉大群,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京100081）

小麥葉銹菌（Puccinia triticina, Pt）引起的小麥葉銹病是世界范圍內(nèi)發(fā)生最普遍，對(duì)經(jīng)濟(jì)影響最嚴(yán)重的小麥病害之一，引入抗病基因是應(yīng)對(duì)小麥葉銹病的根本所在。然而，單一的抗病品種導(dǎo)致寄主選擇壓力，葉銹菌毒性變異頻繁，新的毒性小種不斷出現(xiàn)，往往導(dǎo)致小麥抗葉銹病品種抗性喪失。于是，深入探究小麥抗病相關(guān)基因，并明確它們的功能及其參與的抗病信號(hào)通路，對(duì)于發(fā)掘新的抗病基因及揭示寄主—病原物的互作機(jī)制具有重要的理論和 實(shí)踐意義。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)RNA-seq 已成為基因表達(dá)分析的首選工具［1］，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于鑒定小麥對(duì)生物脅迫的響應(yīng)基因及其代謝通路，通過分析寄主—病原物間親和與非親和互作反應(yīng)中的差異表達(dá)基因，評(píng)估病原物是如何調(diào)節(jié)致病基因的表達(dá)以及如何影響寄主植物的防御反應(yīng)［2］，為發(fā)掘抗病相關(guān)基因或致病因子提供了更加快捷的途徑。張艷俊等［3］對(duì)接種葉銹菌PHNT 后的小麥材料‘TcLr19’進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到了4 個(gè)與抗病相關(guān)的候選基因（NAC 類轉(zhuǎn)錄因子、bZIP 型轉(zhuǎn)錄因子、絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸蛋白激酶）；武文月等［4］基于PHNT 接種‘TcLr19’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到24 個(gè)葉銹菌PHNT 候選效應(yīng)蛋白；Wu 等［5］對(duì)攜帶Lr47 的小麥品種“Lr47-Yecora Rojo-BC6F5”、“Lr47-UC1037”和“Lr47-White Yecora”進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)了863 個(gè)顯著上調(diào)基因和418 個(gè)顯著下調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)Ca2+通道基因（CNGCs、CDPK、Rboh、CaM）、FLS2、RPM1、PR1 及HSP90 等 多個(gè)抗病基因富集顯著。此外，區(qū)別于以上分析病原菌侵染遺傳背景不同的感、抗寄主品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，甲基磺酸乙酯（EMS）化學(xué)誘變與轉(zhuǎn)錄組結(jié)合是研究真菌與寄主抗病相關(guān)基因關(guān)系的有效方法，被廣泛用于克隆植物宿主的抗性基因［6］?；蛲蛔儽蛔C明是引起病原菌變異的主要機(jī)制［7］，EMS 是研究各種生物體突變時(shí)最常用的誘變劑，可引起堿基C/G 到T/A 的變化［8］。利用EMS 人為使病原菌發(fā)生突變后，分析病原物突變前后對(duì)同一抗病品種中基因表達(dá)的不同影響，為抗病基因的篩選甚至小種毒性變異機(jī)制提供更加精確的研究方向。Salcedo 等［9］和Chen 等［10］利用EMS 獲得小麥稈銹菌突變體，分別從小麥稈銹病病原中獲得了無(wú)毒基因AvrSr35 和AvrSr50，極大地促進(jìn)了銹菌無(wú)毒基因的研究進(jìn)展。

小麥抗葉銹病基因Lr19 來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草（Agropyron elongatum），定位于7D 染色體上［11］， 在小麥全生育期表現(xiàn)高抗性。栗小英［12］、高琳等［13］先后從TcLr19 中克隆出抗病相關(guān)基因 TaTLP1 與TaPR1；張家瑞等［14］利用病毒介導(dǎo)基因 沉 默（Virus-induced Gene Silencing , VIGS）技術(shù)證明TaTLP1 具有抗葉銹病功能；梁芳等［15］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法鑒定了TaPR1 的抗病功能，王菲等［16］利用酵母雙雜交（Yeast two-Hybrid Assay,Y2H）、 雙 分 子 熒 光 互 補(bǔ)（Bimolecular fluorescent complimentary, BiFC）和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）明確了TaTLP1與TaPR1 相互作用。以上研究表明Lr19 在小麥抗葉銹病研究方面有巨大應(yīng)用潛力。本課題組前期利用EMS 誘變獲得使小麥TcLr19 感病的葉銹菌PHNT 毒性突變菌株［17］，并證實(shí)發(fā)生突變的位點(diǎn)為AvrLr19。在此基礎(chǔ)上，本研究將野生型PHNT與PHNT 突變體分別接種TcLr19 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以期獲得小麥TcLr19 中在不同反應(yīng)型下的差異表達(dá)基因，通過對(duì)差異表達(dá)基因的GO（Gene Ontology）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，初步明確TcLr19 中抗病相關(guān)基因的種類與功能，以及抗葉銹菌相關(guān)的代謝通路，為進(jìn)一步研究抗葉銹基因Lr19 的抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

植物材料為小麥抗葉銹病近等基因系材料‘TcLr19’；菌株為野生型小麥葉銹菌07-10-426-1（PHNT），以及EMS 處理后的PHNT 突變體（命名為‘M-PHNT’），均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治和分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 采用掃苗法分別接種PHNT 及M-PHNT的夏孢子于一葉一心期的小麥材料‘TcLr19’上，剪取接菌14 d 后的葉片，每組樣本設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。PHNT 接種TcLr19 作為非親和互作樣本組，命 名 為“WT（WT_sample1，WT_sample2，WT_sample3）”，M-PHNT 接種TcLr19 作為親和互作樣本組，命名為“MT（MT_sample4，MT_sample5， MT_sample6）”，用液氮將其迅速冷凍，儲(chǔ)藏于-80 ℃ 冰箱中，備用。

1.2.2 RNA-seq 及原始數(shù)據(jù)處理 將準(zhǔn)備好的樣品送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序工作。利用hisat2［18］將Clean reads 分別與中國(guó)春小麥基因組序列草圖（the bread wheat cultivar Chinese spring）和小麥葉銹菌BBBD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，利用R 語(yǔ)言進(jìn)行Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，檢測(cè)樣品間相關(guān)性。

1.2.3 差異表達(dá)基因分析 利用DESeq 軟件對(duì)各個(gè)樣本基因的counts 數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（采用basemean 值來(lái)估算表達(dá)量），計(jì)算差異倍數(shù)，并采用NB（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對(duì)reads 數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，最終根據(jù)差異倍數(shù)及差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)篩選差異蛋白編碼基因，篩選差異的條件為差異顯著性（P-value）＜0.05 且差異倍數(shù)（Foldchange）＞2。通過R 語(yǔ)言中的ggplot2繪制火山圖和MA 圖了解差異表達(dá)基因的整體分布情況。

1.2.4 差異表達(dá)基因GO 和KEGG 分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析［19］，結(jié)合GO 數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.geneontology.org/）對(duì)其功能進(jìn)行描述。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）對(duì)差異蛋白編碼基因進(jìn)行代謝通路（Pathway）分 析［20］，并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)Pathway 條目中差異基因富集的顯著性。計(jì)算的結(jié)果會(huì)返回一個(gè)富集顯著性的P-value，較小的P-value表示差異基因在該P(yáng)athway 中出現(xiàn)顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序reads 基因組比對(duì)結(jié)果及樣本相關(guān)性分析

將reads 與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)， 獲得WT 和MT 樣本比對(duì)上寄主小麥及葉銹菌參考序列比率信息（圖1A）。WT 樣本組，寄主比對(duì)上參考基因組的序列所占百分比分別為89.34%、87.49%和90.16%，葉銹菌比對(duì)上參考基因組的序列所占百分比分別為5.33%、4.18%和2.53%；MT樣本組，寄主比對(duì)上參考基因組的序列所占百分比分別為65.04%、48.74% 和58.37%，葉銹菌比對(duì)上參考基因組的序列所占百分比分別為20.16%、32.3% 和26.87%。分析結(jié)果顯示，野生型葉銹菌株突變后對(duì)Lr19 產(chǎn)生毒性，成功侵染抗病品種‘TcLr19’。根據(jù)基因表達(dá)情況獲得測(cè)序樣品間的相關(guān)系數(shù)圖如圖1B 所示，對(duì)于整體基因表達(dá)水平，在生物學(xué)重復(fù)中觀察到明顯的相關(guān)性。以上結(jié)果表明，送測(cè)樣本合理，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠，可進(jìn)行深入的分析。

圖1 測(cè)序reads 基因組比對(duì)結(jié)果及樣本相關(guān)性分析Fig. 1 Genome comparison results and sample correlation analysis of sequencing reads

2.2 差異表達(dá)基因篩選

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在WT 中共檢測(cè)到 66 768 個(gè)基因表達(dá)，在MT 中檢測(cè)到68 383 個(gè)基因表達(dá)，以P-value ＜0.05 且Foldchange ＞2 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，2 個(gè)樣本組中共篩選到2 114 個(gè)差異表達(dá)基因（圖2A），其中有1 189 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，925個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（圖2B）。MA 圖（圖2C）和火山圖（圖2D）反映了差異表達(dá)基因整體分布情況。結(jié)果表明，非親和反應(yīng)中有大量抗病相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，筆者將重點(diǎn)分析差異表達(dá)基因中的上調(diào)表達(dá)基因。

圖2 WT-VS-MT 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)（差異倍數(shù)大于2，差異顯著性小于0.05）Fig. 2 DEGs in WT-VS-MT （fold change ＞ 2, P-value ＜ 0.05）

2.3 差異表達(dá)基因GO 和KEGG 分析

對(duì)1 189 個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，上調(diào)的差異表達(dá)基因被注釋為氧化還原、真菌防御、過氧化氫酶活性和幾丁質(zhì)酶活性等功能。對(duì)GO 注釋條目進(jìn)行進(jìn)一步篩選，列舉出部分GO 分類條目中的抗病相關(guān)基因（見表1），在WT 樣本小麥中β-1,3-葡聚糖酶以及過氧化氫酶等基因上調(diào)表達(dá)，幾丁質(zhì)酶表達(dá)數(shù)量較多，這些結(jié)果表明了以上基因和小麥抗病反應(yīng)有密不可分的關(guān)系。

其中過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酰基輔酶A 還原酶分別被富集到過氧化物酶（Peroxisome，ko04146）、氨基糖/ 核苷酸糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism，ko00520）和角質(zhì)生物合成（Cutin biosynthesis，ko00073）3 個(gè)代謝通路中（表1），說明這些信號(hào)通路參與了TcLr19抗葉銹病過程。

表1 WT-VS-MT 差異表達(dá)基因GO 和KEGG 分析Table 1 GO and KEGG analysis of WT-VS-MT DEGs

2.4 葉銹菌誘導(dǎo)位于7D 染色體上的差異表達(dá)基因

由于攜帶Lr19 基因的染色體被證實(shí)是普通小麥中的7D 染色體，因此本研究重點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中位于7D 染色體上的差異表達(dá)基因進(jìn)行了探索。與親和互作組相比，許多位于7D 染色體上的基因被誘導(dǎo)差異表達(dá)，共鑒定了10 個(gè)差異表達(dá)基因（表2），利用Mapchart 軟件繪制了其在7D 染色體上的定位（圖3）。醛脫氫酶2C4、細(xì)胞色素P450、病程相關(guān)蛋白1 ～4、乙烯轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白基因在WT 中的表達(dá)量高于MT 組；另外，本研究發(fā)現(xiàn)，有5 個(gè)基因TraesCS7D02G027600、TraesCS7D02G320200、TraesCS7D02G353900、TraesCS7D02G387000 和TraesCS7D02G479300，分別編碼Fe2+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因（MEBL）、蛋白連接酶（FBL23）、醛脫氫酶，半胱氨酸活性位點(diǎn)（ALDH2C4）、二酰基甘油激酶（DGK5）和GTP 結(jié)合蛋白（OBGM），這5 個(gè)基因只在非親和互作組中表達(dá)。以上結(jié)果表明，7D 染色體上的許多基因在小麥抗病反應(yīng)中扮演了重要的角色，尤其是在非親和反應(yīng)中特異表達(dá)的5 個(gè)基因發(fā)揮了更重要的抗病功能。

表2 定位于7D 染色體上的差異表達(dá)基因（WT-VS-MT）Table 2 DEGs located on chromosome 7D（ WT-VS-MT）

圖3 WT-VS-MT 差異表達(dá)基因7D 染色體定位Fig.3 Distribution map of DEGs located on chromosome 7D

3 討論與結(jié)論

植物受到生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的防御反應(yīng)基因的表達(dá)模式就會(huì)發(fā)生變化，起到抵抗外界物質(zhì)侵染的作用。根據(jù)“基因?qū)颍╣ene-for-gene）”學(xué)說［21］，病原物無(wú)毒基因和毒性基因會(huì)對(duì)植物體內(nèi)基因的表達(dá)情況產(chǎn)生不同的影響，在非親和互作反應(yīng)中，植物體內(nèi)的抗病相關(guān)基因會(huì)上調(diào)表達(dá)。張艷?。?2］利用RNA-Seq 分析了葉銹菌PHNT 接種TcLr19 后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶活性和轉(zhuǎn)錄因子活性基因在特定的時(shí)間內(nèi)上調(diào)表達(dá)。范學(xué)峰［23］用葉銹菌THTT 分別接種TcLr19 和TcLr19 突 變 體，RNA-Seq 分 析 結(jié) 果 顯示在TcLr19 抗病反應(yīng)中氧化還原代謝通路富集顯著。與以上研究不同的是，本研究針對(duì)田間尚未發(fā)現(xiàn)Lr19 毒性葉銹菌菌株的現(xiàn)狀，在利用EMS 創(chuàng)制了對(duì)TcLr19 具有毒性的PHNT 突變體的基礎(chǔ)上，進(jìn)行全基因組范圍抗病相關(guān)基因的篩選。PHNT 突變體僅針對(duì)Lr19 毒性位點(diǎn)發(fā)生了改變，對(duì)比PHNT 和M-PHNT 兩種菌株分別誘導(dǎo)TcLr19 中的差異表達(dá)基因，增強(qiáng)了對(duì)Lr19 抗病及抗病相關(guān)基因研究的目的性。當(dāng)然，植物體內(nèi)除被病原物誘導(dǎo)表達(dá)的基因外，還存在一部分組成型表達(dá)的抗病相關(guān)基因，比如小麥中S2A2 基因［24］。所以，想要全面篩選Lr19 抗病及抗病相關(guān)基因，只分析差異表達(dá)基因是不夠的，在后續(xù)研究中，會(huì)同時(shí)對(duì)兩組中的非差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選分析，完善對(duì)Lr19 抗病機(jī)制的研究。

GO 分析結(jié)果顯示，部分差異表達(dá)基因被注釋為β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等功能。幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要組成物質(zhì)，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶協(xié)同表達(dá)時(shí)，可以分解病原真菌的細(xì)胞壁以抵御侵害［25］，本課題組在前期研究中也報(bào)道β-1,3-葡聚糖酶基因的表達(dá)明顯受葉銹菌的誘導(dǎo)，并參與了小麥抗葉銹病防御反應(yīng)［26］。本研究中發(fā)現(xiàn)了新的抗病相關(guān)基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，GO富集分析為TcLr19 中抗病相關(guān)基因的篩選縮小了范圍，在下一步工作中將進(jìn)行表達(dá)分析和功能驗(yàn)證。

KEGG 可以將基因與基因表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，為明確抗病相關(guān)代謝通路和系統(tǒng)篩選抗病的相關(guān)基因提供思路。余穎豪等［27］通過對(duì)金針菇菌絲階段和原基形成階段的轉(zhuǎn)錄組分析，明確了金針菇冷誘導(dǎo)形成原基的分子機(jī)制及調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)。在KEGG 富集結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)了過氧化物酶、氨基糖/ 核苷酸糖代謝和角質(zhì)生物合成3 個(gè)代謝 通路在WT 非親和互作反應(yīng)中富集顯著，與張繩 敏［28］、柴乖強(qiáng)［29］等先前研究報(bào)道的過氧化物以及角質(zhì)生物合成相關(guān)基因參與小麥抗病反應(yīng)結(jié)果相符。KEGG 分析初步明確了以上3 個(gè)代謝通路參與了TcLr19 的抗病過程，接下來(lái)會(huì)繼續(xù)關(guān)注與這些代謝通路相關(guān)的基因和通路，探索TcLr19 的抗病代謝網(wǎng)絡(luò)。

此外，本研究對(duì)與Lr19 同在7D 染色體上的差異表達(dá)基因進(jìn)行專項(xiàng)分析，篩選出7D 染色體上的部分抗病相關(guān)基因，其中有5 個(gè)基因在抗病反應(yīng)中特異性表達(dá)，有可能抗病關(guān)系更加密切，后續(xù)將對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、qRT-PCR 以及功能驗(yàn)證，以確定其在TcLr19 抗葉銹病防御反應(yīng)中的作用，有助于進(jìn)一步分析Lr19 對(duì)抗病相關(guān)基因的調(diào)控。