文英會，邱天寶，劉占通，吳慧豪

(1.河南牧業(yè)經濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

氟苯尼考粉是一種動物專用的酰胺醇類廣譜抗生素[1]，對呼吸道和消化道疾病治療效果明顯。乙酰甲喹又稱痢菌凈[2]，具有廣譜抗菌活性，主要用于雛雞白痢、禽巴氏桿菌病的防治。獸藥中非法添加現(xiàn)象時有發(fā)生，其中就包括氟苯尼考粉中存在非法添加物的現(xiàn)象[3]。個別生產企業(yè)為了提高防治疾病的效果或者減少不良反應，在氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹，隱藏了乙酰甲喹的使用，可能在動物源性食品中造成乙酰甲喹殘留的嚴重后果[4]，這類不合規(guī)獸藥給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成安全隱患，并對人類食品安全帶來威脅。

目前，對氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的檢測暫無標準規(guī)定?；诋斍暗氖袌霏h(huán)境，建立一種相應的檢測方法很有必要。本研究建立了高效液相色譜法對氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的檢測，可望對控制乙酰甲喹的非法添加起到作用。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配置UPLC PDA光電二極管陣列檢測器/UPLC TUV紫外檢測器；超純水機(美國Millipore公司)；XS205電子天平(瑞士Mettler TOLEDO公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺等；乙酰甲喹對照品：批號H0111505，含量99.6%，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 供試品

氟苯尼考粉樣品，由河南某制藥有限公司提供，規(guī)格100 g∶10 g，質量符合《中國獸藥典》2020版一部質量標準，經檢測不含乙酰甲喹，即為陰性樣品。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取乙酰甲喹對照品約10 mg于50 mL容量瓶中，加乙腈適量，超聲10 min使其溶解，放冷至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的標準品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備

取陰性樣品約1 g于50 mL容量瓶中，加乙腈適量，超聲15 min使其大部分溶解，放冷至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻濾過，濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

流動相為乙腈-水(40∶60)；色譜柱：Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長256 nm；流速1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫30 ℃。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密量取2.1、2.2項下的溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，量取10 μL注入高效液相色譜儀，再精密量取2.1項下的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.5 線性關系考察

精密量取2.1項下的標準品貯備液適量，用乙腈稀釋成0.002、0.004、0.01、0.02、0.04 mg/mL的系列混合標準溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，按2.3項下的色譜條件進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，求得其線性回歸方程。

2.6 添加回收試驗

取2.2項下的供試品溶液，精密量取1 mL，加入10 mL容量瓶平行6份實驗，在容量瓶中精密加入乙酰甲喹對照品溶液1 mL(相當于約0.2197 mg的乙酰甲喹)，用乙腈定容，精密吸取10 μL，按上述方法測定，計算其回收率。

2.7 檢測限

將2.1項下的對照品溶液進行梯度稀釋后添加到陰性氟苯尼考粉中，按2.3項下的方法進行檢測，以乙酰甲喹光譜圖不失真的最低添加含量作為檢測限。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，于制備后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入高效液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進行測定，計算乙酰甲喹峰面積的RSD值。

3 結果

3.1 系統(tǒng)適應性試驗

在該色譜條件下，提取256 nm處的色譜圖，按出峰時間的先后順序依次為乙酰甲喹、氟苯尼考，理論塔板數(shù)高，相鄰色譜峰的分離度符合要求，結果見表1，有關色譜圖如圖1，相應對照品的色譜圖如圖2。

表1 系統(tǒng)適應性實驗數(shù)據(jù)

圖1 乙酰甲喹和氟苯尼考混合溶液在256 nm的色譜圖

圖2 乙酰甲喹對照品溶液在256 nm的色譜圖

3.2 線性關系考察

上機后不同的對照品濃度與相應的色譜峰面積如表2所示。

表2 不同對照品濃度與峰面積

以稀釋后的標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，如圖3所示，求得線性回歸方程為Y=3.76×108X-8130及相關系數(shù)r=0.9999。結果表明，在該實驗條件下，乙酰甲喹的濃度在0.002～0.04 mg/mL的濃度范圍內，濃度與峰面積呈良好的線性關系。

圖3 乙酰甲喹對照品的標準曲線

3.3 添加回收試驗

結果如表3所示，乙酰甲喹的回收率在99.0%～99.8%范圍內，平均回收率在99.0%，RSD值為0.4%，符合回收率的范圍，說明該法具有良好的回收率。

表3 乙酰甲喹回收率

3.4 檢測限

將乙酰甲喹溶液進行梯度稀釋后，記錄乙酰甲喹的色譜圖及光譜圖，結果如圖4、圖5、圖6、圖7所示：當乙酰甲喹含量在0.2 mg/g、2 mg/g時，乙酰甲喹的色譜圖以及紫外吸收光譜圖均在理論范圍之內，說明可以清楚地檢測到乙酰甲喹。如圖8、圖9所示：當乙酰甲喹含量在0.02 mg/g時，乙酰甲喹的峰值、吸收波長均不符合標準，說明基本檢測不到乙酰甲喹。故得出結論：本方法的檢測限為0.2 mg/g。

圖4 乙酰甲喹添加量為2 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖5 乙酰甲喹添加量為2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

圖6 乙酰甲喹添加量為0.2 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖7 乙酰甲喹添加量為0.2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

圖8 乙酰甲喹添加量為0.02 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖9 乙酰甲喹添加量為0.02 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

3.5 穩(wěn)定性實驗結果

上機進樣量均為10 μL，觀察色譜圖成峰效果，見表4。乙酰甲喹峰面積的RSD值為0.1%。這表明樣品溶液在24 h內非常穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)

4 討論與小結

4.1 色譜條件、提取溶劑以及提取波長的選擇

色譜條件的選擇是參考了乙酰甲喹含量檢測以及氟苯尼考粉中非法添加檢測的相關文獻[5-6]，再通過多次篩選，最后確立了合適的色譜條件；參考乙酰甲喹含量檢測的相關文獻，表明乙酰甲喹在波長為256 nm處有最大吸收峰值，通過實驗選擇檢測波長為256 nm。由乙酰甲喹的性質得知，乙酰甲喹溶于甲醇，且甲醇又是流動相，所以選擇甲醇為提取溶劑。

4.2 檢測限的確立

方法采用PDA檢測器，對乙酰甲喹定性定量的同時進行測定，節(jié)約了時間。由于需要對乙酰甲喹先進行定性檢測，所以與傳統(tǒng)含量測定方法(信號和噪聲的比例為3∶1)不同，方法以光譜圖未失真時的乙酰甲喹含量作為檢測限。

4.3 方法評價

本研究建立了氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹測定的高效液相色譜方法。該方法簡便快捷，靈敏度高，準確性強，可以有效檢測氟苯尼考粉中非法添加的乙酰甲喹，為氟苯尼考粉的質量標準修訂提供了參考。