潘有光 傅文凡 莫益俊 趙健 陳崗東

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州510150）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（廣州510095）；3南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院（廣東深圳518000）

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有原發(fā)性肺癌病例的80%［1］。在我國城市人口中，肺癌的發(fā)病率及病死率均居首位，且大多數(shù)NSCLC 患者確診時(shí)已是晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，化療藥物如順鉑（cisplatin，DDP）等廣泛應(yīng)用于一線治療晚期NSCLC 患者［2-3］。然而，多數(shù)患者在經(jīng)過化療后會(huì)對DDP 產(chǎn)生耐藥［4-7］，使治療效果減弱甚至失效，導(dǎo)致預(yù)后不良［8］。因此，迫切需要了解NSCLC 產(chǎn)生DDP 耐藥的分子機(jī)制，尋找新的治療策略以克服DDP 耐藥。

microRNAs（miRNAs）是一類單鏈、小分子非編碼RNA（長度為19～25 個(gè)核苷酸），通過與靶基因的互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)水平［9］。已經(jīng)證明，大約60%的細(xì)胞蛋白編碼基因是由miRNA 調(diào)控的［10］。同時(shí)，miRNA 也參與了NSCLC 的化療耐藥［11-12］。研究［13］表明，過表達(dá)miR-146a 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加NSCLC 對DDP 的敏感性。miR-181c 在NSCLC 組織中上調(diào)，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞對DDP 的耐藥［14］。然而，miR-92b-3p 是否在NSCLC 中介導(dǎo)耐藥尚未明確。本研究擬闡明miR-92b-3p 在NSCLC 細(xì)胞中對DDP 耐藥的生物學(xué)功能，初步發(fā)現(xiàn)了miR-92b-3p 可能通過調(diào)控RAD21基因的表達(dá)來介導(dǎo)細(xì)胞對DDP的藥物敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑順鉑（DDP，江蘇豪森藥業(yè)）；Cell Counting Kit-8（日本化學(xué)同仁研究所）；Trizol（美國invitrogen 公司）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI公司）；microRNA 熒光定量PCR 試劑盒（美國ABI公司）；miRNAmimics（上海吉瑪公司）；miRNAinhibitors（美國Dharmacon 公司）；雙熒光素酶檢測試劑盒（美國promega 公司）；一抗anti-RAD21（美國cell signaling techonology 公司）；一抗anti-β-actin（美國ProteintechGroup 公司）；二抗goatanti-mouse（美國invitrogen 公司）；cDNA 合成試劑盒及PCR 試劑盒（大連寶生物有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及體外順鉑耐藥株的建立NSCLC親本細(xì)胞A549由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。以A549細(xì)胞系為親本，采用順鉑富集法逐步誘導(dǎo)形成A549/DDP（順鉑耐藥）細(xì)胞。最終誘導(dǎo)藥物濃度達(dá)到6 μg/mL。當(dāng)細(xì)胞在6 μg/mL的順鉑中存活2個(gè)月且活性正常時(shí)，證實(shí)為耐順鉑細(xì)胞株，命名為A549/DDP。A549/DDP 培養(yǎng)基含有2 μg/mL 的順鉑以維持細(xì)胞的耐藥性。取對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。

1.3 miRNA表達(dá)的微陣列檢測用總RNA純化試劑盒分離A549 細(xì)胞和A549/DDP 細(xì)胞的總RNA。使用服務(wù)提供商（LCSciences）進(jìn)行微陣列分析。使用激光掃描儀采集雜交圖像，然后用Array-Pro圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，比較A549 和A549/DDP的表達(dá)譜，用紅色（高表達(dá)）到綠色（低表達(dá)）表示兩組表達(dá)差異的比值，計(jì)算t檢驗(yàn)的P值，P＜0.01的信號(hào)為差異檢測信號(hào)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物敏感性分析miR-92b-3p mimic（miR-92b-3p）和miRNA 陰性對照（miR-NC）、miR-92b-3p inhibitor（anti-miR-92b-3p）、inhibitor 陰性對照（anti-miR-NC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染步驟按操作指南進(jìn)行。24 h 后換液。然后用DDP（濃度梯度為0、3、6、9、12、15 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加10%CCK8 培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h 后，酶標(biāo)儀測定吸收值。計(jì)算不同藥物濃度下的半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）值。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time-PCR）用Trizol試劑（Invitrogen，USA）從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從總RNA 中獲得cDNA，合成的cDNA 在Real-timePCR 儀 檢 測miRNA 和mRNA的表達(dá)水平。

1.6 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測利用pGL3-MCScontrol質(zhì)粒進(jìn)行基因3′UTR區(qū)域熒光報(bào)告基因的克隆構(gòu)建。利用Primer Premier 5.0 分別設(shè)計(jì)RAD21的3′UTR 引物，克隆到報(bào)告基因載體pGL3-MCScontrol 中，構(gòu)建成雙熒光報(bào)告系統(tǒng)pGL3-RAD21-3′UTR-WT，pGL3-RAD21-3′UTR-MUT。A549 接種24 h 后，共轉(zhuǎn)染miRNA mimics 或NC 對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，雙熒光素酶試劑盒進(jìn)行檢測。

1.7 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞后收集蛋白，測量蛋白濃度后，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后2.5%脫脂奶粉的PBST 及一定比例的RAD21及β-actin抗體結(jié)合，4 ℃過夜。室溫下二抗孵育1 h，最后進(jìn)行曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5 Demo 以及SPSS 18.0 軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間差異用one-wayANOVA 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 miRNA 基因芯片篩選靶基因本研究使用miRNA 芯片分析比較了A549/DDP 及A549 細(xì)胞株的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有33個(gè)miRNA在A549/DDP細(xì)胞與A549 細(xì)胞表達(dá)上差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。圖1B 列出了差異表達(dá)水平相對較高的miRNAs。值得注意的是，幾個(gè)差異表達(dá)明顯的miRNA（miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-92a、miR-92b 及miR-106a）包含相同的種子序列，在A549/DDP 細(xì)胞中顯著下調(diào)，通過前期的一些預(yù)實(shí)驗(yàn)后，最終篩選出miR-92b-3p作為進(jìn)一步研究的對象。

2.2 miR-92b-3p在A549/DDP細(xì)胞系中下調(diào)qRTPCR 結(jié)果顯示，與A549 相比，A549/DDP 中miR-92b-3p 的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖2A）。此外，藥物敏感性試驗(yàn)表明，與A549/DDP 相比，A549 的耐藥性明顯下降。這些結(jié)果表明，異常表達(dá)的miR-92b-3p 可能與NSCLC 細(xì)胞對DDP 的耐藥有關(guān)（圖2B、C）。

圖1 miRNA 基因芯片篩選靶基因Fig.1 Screening target genes by miRNA microarray

圖2 A549 及A549/DDP 中的miR-92b-3p 相對表達(dá)量及DDP 濃度梯度下各自的IC50Fig.2 The relative expression of mir-92b-3p in A549 and A549/DDP and the respective IC50 under the concentration gradient of DDP

2.3 miR-92b-3p 可上調(diào)A549/DDP 細(xì)胞對DDP 的敏感性將A549/DDP 細(xì)胞株同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-92b-3p mimics 及miR-NC，CCK-8 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-92b-3p mimics 的A549/DDP 細(xì)胞株IC50值顯著降低，對順鉑敏感性增加。見圖3。

2.4 miR-92b-3p 的下調(diào)可降低A549 細(xì)胞對DDP的敏感性將anti-miR-92b-3p 及anti-miR-NC 分別轉(zhuǎn)染親本A549 細(xì)胞，qRT-PCR 驗(yàn)證miR-92b-3p 在A549 細(xì)胞中的下調(diào)（P＜0.01，圖4A）。CCK-8 結(jié)果顯示：下調(diào)A549 細(xì)胞株中miR-92b-3p 將顯著提升其對順鉑的耐藥性，見圖4B、4C。

2.5 RAD21 是A549/DDP 細(xì)胞中miR-92b-3p 的直接靶點(diǎn)本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)站對miR-92b-3p 的靶基因進(jìn)行了預(yù)測和鑒定。RAD21 被預(yù)測為miR-92b-3p 的結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。雙熒光素酶報(bào)告基因測定顯示：與共轉(zhuǎn)染陰性對照相比，報(bào)告基因載體pGL3-RAD21-3′UTR 共轉(zhuǎn)染miR-92b-3p mimics的熒光素酶活性顯著降低；RAD21是miR-92b-3p 的一個(gè)新的靶基因（圖5B）。

圖3 miR-92b-3p mimics 的轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組與對照組對順鉑的敏感性Fig.3 The transfection efficiency of miR-92b-3p mimics and the sensitivity of the experimental group and the control group to cisplatin after transfection

圖4 miR-92b-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染效率及實(shí)驗(yàn)組與對照組對順鉑的敏感性Fig.4 The transfection efficiency of miR-92b-3p inhibitor and the sensitivity of the experimental group and the control group to cisplatin after transfection

2.6 Western Blot在A549/DDP 細(xì)胞中，與miRNC組相比，過表達(dá)miR-92b-3p可抑制RAD21mRNA和蛋白質(zhì)含量。反之，如果抑制A549細(xì)胞中的miR-92b-3p，可上調(diào)RAD21mRNA 和蛋白質(zhì)含量。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，RAD21 可能是miR-92b-3p 的直接靶點(diǎn)（圖6）。

3 討論

化療耐藥性仍然是目前治療NSCLC 遇到的瓶頸。然而，NSCLC 治療中耐藥的分子機(jī)制在很大程度上仍有待于闡明。近年來，人們認(rèn)為多種分子通路參與了耐藥性的形成，包括異常的藥物攝取和外排、DNA 修復(fù)功能的增強(qiáng)、凋亡通路的中斷、細(xì)胞解毒的激活等［15］。此外，有證據(jù)表明，基因和表觀遺傳變化，如擴(kuò)增、易位、突變和組蛋白翻譯后修飾也有助于化療期間的耐藥性［16-17］。最近，有研究報(bào)道，miRNAs 在獲得性DDP 耐藥方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這為開發(fā)新的基于miRNA 的治療藥物克服NSCLC 的耐藥帶來了希望［18］。MA 等［19］發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M-2B4 中，用順鉑處理過的PC-3M-2B4 細(xì)胞株，其miR-92b-3p 的表達(dá)是下調(diào)的，而GSTM3 的表達(dá)卻是上調(diào)的，表明miR-92b-3p 可以通過負(fù)向調(diào)控GSTM3 的表達(dá)而改變前列腺癌對順鉑的敏感性。

圖5 miR-92b-3p 與RAD21 的3′UTR 的潛在結(jié)合點(diǎn)及熒光素酶活性Fig.5 Potential binding site and luciferase activity of 3′UTR of mir-92b-3p and RAD21

圖6 miR-92b-3p 對A549 及A549/DDP 中RDA21 mRNA 及蛋白的影響Fig.6 Effects of miR-92b-3p on the expression of RDA21 mRNA and protein in A549 and A549/DDP

本研究中，qPCR 結(jié)果顯示miR-92b-3p在A549/DDP 細(xì)胞株中的表達(dá)明顯下調(diào)，表明miR-92b-3p可能參與NSCLC 的耐藥。通過TargetScan、Pictar和miRBaseTargets 等生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-92b-3p 的下游靶基因是RAD21。RAD21基因位于人染色體8q24.11上，其編碼一種人類同源的非洲酒酵母RAD21 蛋白，是內(nèi)聚蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵核心成分［20］，主要功能是在有絲分裂的中后期保證染色體的正確分離［21］。同時(shí)，它還參與了染色體的同源重組及DNA 雙鏈修復(fù)等過程［22］。研究發(fā)現(xiàn)，RAD21 基因的敲除可顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對5-FU、環(huán)磷酰胺和依托泊苷的敏感性［23］，說明其可修復(fù)化療藥物介導(dǎo)的DNA 損傷。miR-92b-3p 的低表達(dá)可增強(qiáng)G2 期RAD21 介導(dǎo)的DNA 修復(fù)，減少S 期順鉑誘導(dǎo)的DNA 損傷，導(dǎo)致順鉑耐藥。在本研究中，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，在DDP 耐藥的NSCLC 細(xì)胞中，miR-92b-3p 可以與RAD21 的3′-UTR 結(jié)合。過表達(dá)miR-92b-3p 可抑制DDP 耐藥NSCLC 細(xì)胞株中RAD21 的mRNA 和蛋白表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，miR-92b-3p 通過直接靶向NSCLC 細(xì)胞中的RAD21，高表達(dá)的RAD21 可以幫助細(xì)胞在S 期有更多的機(jī)會(huì)修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的DNA 損傷，使腫瘤細(xì)胞化療期間保持順鉑耐藥性。

本研究結(jié)果顯示，與DDP 敏感的親代A549 細(xì)胞相比，A549/DDP 細(xì)胞中miR-92b-3p 的表達(dá)明顯下調(diào)?；謴?fù)miR-92b-3p 可通過靶向RAD21 增加A549/DDP 細(xì)胞對DDP 的敏感性，這些發(fā)現(xiàn)可能為克服DDP 耐藥NSCLC 的治療提供一個(gè)有希望的生物標(biāo)志物。然而必須承認(rèn)，耐藥是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控體系，本研究只是其中的冰山一角，并且驗(yàn)證藥物單一，本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步闡明下游的信號(hào)通路及上游與長非編碼RNA 的調(diào)控關(guān)系，并在臨床大樣本中驗(yàn)證，從而為肺癌耐藥機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。