李登峰 劉 旋 劉 剛

目前，醫(yī)學(xué)影像技術(shù)已成功實現(xiàn)在組織、細(xì)胞及分子水平對活體狀態(tài)下的生物學(xué)過程進(jìn)行無創(chuàng)監(jiān)測與實時分析，分子影像探針的應(yīng)用極大地提高了其在生物體內(nèi)檢測的廣度和深度，為疾病的早期篩查、療效監(jiān)測及預(yù)后評估提供依據(jù)［1-2］。報告基因是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因［3］，作為新興分子影像探針，將報告基因轉(zhuǎn)入生物體后，通過影像技術(shù)檢測其表達(dá)產(chǎn)物釋放的信號，能獲得基因表達(dá)水平和細(xì)胞定位等生物學(xué)信息。目前已有光學(xué)報告基因應(yīng)用于研究基因表達(dá)的時空性與特異性，但因其表達(dá)產(chǎn)物受光散射和組織自發(fā)熒光干擾較大，難以獲得高分辨率的深層組織圖像。超聲成像是一種非侵入性的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，通過接收、分析、顯示反射及散射的超聲波信號，獲得體內(nèi)器官的功能和解剖信息［4］。與光子僅能穿透毫米級的軟體組織不同，超聲波的方向性好，組織穿透能力強(qiáng)，并易于獲得較集中的聲能。因此，將報告基因編碼產(chǎn)物作為分子影像探針引入超聲成像研究，在分子水平實現(xiàn)深層組織的可視化和動態(tài)監(jiān)測，具有良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。本文就多種報告基因在超聲成像中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、微氣泡超聲分子探針

微氣泡超聲分子探針能有效提高超聲成像的敏感性和準(zhǔn)確性，已廣泛應(yīng)用于血管成像、炎癥檢測及腫瘤檢查，為實現(xiàn)細(xì)胞和分子水平深層組織可視化和動態(tài)監(jiān)測提供了可能［5］。有文獻(xiàn)［6］報道注射鹽水后的主動脈根部在M 型超聲下的結(jié)構(gòu)顯影明顯增強(qiáng)，首次提出超聲對比造影的概念。此后，多種微氣泡造影劑被研發(fā)成功并應(yīng)用于臨床。靶向微泡分子探針為第三代聲振含氣微泡，目前臨床應(yīng)用較少，多處于實驗和臨床轉(zhuǎn)化階段，有較好的體內(nèi)穩(wěn)定性，可穿過血管壁進(jìn)入組織間隙進(jìn)行組織成像。微氣泡超聲造影需要靶區(qū)周圍或靶區(qū)內(nèi)存在足夠數(shù)量的超聲微泡［7］，具有靶向性的第三代微氣泡雖可以特異性地集中在靶區(qū)，但配體與受體間的親和力不盡相同，微泡的靶向富集能力亦隨之改變，很難應(yīng)對超聲造影監(jiān)控基因表達(dá)水平時的復(fù)雜生理學(xué)環(huán)境。因此，需根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域的不同綜合考慮粒徑、靶向及穿透能力等多方面因素，利用合成生物學(xué)的研究成果進(jìn)一步開發(fā)生物來源的超聲分子影像探針及適用于超聲檢測的報告基因系統(tǒng)。

二、用于超聲成像的報告基因及其編碼產(chǎn)物種類

將報告基因成功轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞或生物體中是其應(yīng)用于分子影像技術(shù)的前提。分子生物學(xué)研究中應(yīng)用的表達(dá)載體均可作為傳送報告基因的中介物質(zhì)。報告基因與載體的整合方法包括基因融合法、雙順反子法及共載體法等。整合后的報告基因在特異啟動子或增強(qiáng)子元件控制下啟動轉(zhuǎn)錄并翻譯成為相應(yīng)產(chǎn)物，提供影像學(xué)信息。理想化的超聲報告基因應(yīng)具有以下條件：①報告基因編碼產(chǎn)物的過程不應(yīng)過于復(fù)雜，檢測方式也應(yīng)簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性良好；②編碼產(chǎn)物不應(yīng)具有免疫原性，在體內(nèi)的穩(wěn)定性較好；③成像信號與編碼產(chǎn)物間應(yīng)具有良好的相關(guān)性。

1.偽空胞：1895 年德國微生物學(xué)家Klebahn 利用光學(xué)顯微鏡觀察到藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)存在含有氣體略帶紅色的氣囊。隨后，有學(xué)者［8-9］陸續(xù)在古細(xì)菌（嗜鹽菌和產(chǎn)甲烷菌）和革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了類似的氣囊結(jié)構(gòu)，并將其命名為偽空泡或偽空胞（GVs）。與水中氣泡的簡單結(jié)構(gòu)不同，GVs 具有以下特征：①大部分呈圓柱形或紡錘形；②GVs 的兩親性外殼厚約2 nm，在與周圍介質(zhì)進(jìn)行氣體交換時可阻止水分滲入；③GVs 內(nèi)部氣體壓力小于同等大小的水中氣泡，可以承受高達(dá)1.3 MPa的壓力，這種抗壓能力一方面來源于韌性外殼，另一方面可能與內(nèi)部存在的包膜結(jié)構(gòu)有關(guān)［10-11］。Shapiro等［12］提出將GVs作為超聲造影劑，提取了來自水華魚腥藻和鹽生桿菌NRC-1 的GVs，體外實驗顯示3.5 μg/ml的GVs在超聲介導(dǎo)下產(chǎn)生了聲信號，其濃度和聲信號強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；體內(nèi)實驗顯示通過靜脈注射的GVs富集于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的肝臟組織中，增強(qiáng)了組織在超聲圖像中的對比度。另有研究［9］報道了一種基于空胞蛋白（Gvp）C 蛋白的重組GVs 構(gòu)建方案，通過6-M 尿素處理純化后的水華魚腥藻GVs，可以較簡便地除去外層的GvpC蛋白，處理后的GVs 與大腸桿菌重組表達(dá)的另一種GvpC 共同孵育，二者通過分子間作用力重新組合，除去游離組分后即得到了重組GVs。相比于重組蛋白組分，這種構(gòu)建方式不僅能夠改變其蛋白成分，還可以對外部的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行功能化改造，在用以制備GVs 分子探針的同時體現(xiàn)了gvpA 和gvpC 作為超聲成像報告基因的潛力。

2.生物素連接酶（BirA）及其受體肽：BirA 是一種存在于大部分微生物體內(nèi)的生物素連接酶，能夠在體內(nèi)催化生物素對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，包含3 個結(jié)構(gòu)域：N 端結(jié)構(gòu)域、C 端結(jié)構(gòu)域及中心催化結(jié)構(gòu)域［13-14］。BirA 的中心催化結(jié)構(gòu)域可催化生物素和三磷酸腺苷酶（ATP）反應(yīng)形成5’-AMP-biotin 活化中間產(chǎn)物，靶蛋白中賴氨酸殘基的ε 氨基隨后與中間產(chǎn)物結(jié)合，并將生物素以酰胺鍵結(jié)合形式轉(zhuǎn)移至靶蛋白質(zhì)上。當(dāng)融合生物素受體肽（BAP）的蛋白和BirA 共表達(dá)時，BAP 序列可以被有效生物素化，生物素化的蛋白質(zhì)可被親和素標(biāo)記［15］。Tannous 等［16］設(shè)計了一種重組報告蛋白，其N 端信號序列和跨膜結(jié)構(gòu)域之間包含BAP序列，將該重組蛋白序列轉(zhuǎn)染進(jìn)入BHK-12細(xì)胞后，BAP序列可被細(xì)胞中內(nèi)源性的生物素連接酶生物素化，最終將生物素展示在細(xì)胞表面；體內(nèi)實驗顯示，轉(zhuǎn)染有報告基因的Gli36 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞被用于構(gòu)建小鼠皮下瘤模型，向小鼠體內(nèi)注射親和素偶聯(lián)的熒光分子探針后，可對皮下腫瘤的生長情況進(jìn)行實時監(jiān)測。與光學(xué)成像中熒光素酶報告基因系統(tǒng)相似，基于BirA及其受體肽的報告系統(tǒng)需要親和素偶聯(lián)的分子探針作為“底物”，二者共同作用產(chǎn)生影像學(xué)信號。但該報告系統(tǒng)更加靈活，成像模式可依據(jù)分子探針的不同而改變。隨著第三代微氣泡制備技術(shù)的成熟與完善，以偶聯(lián)親和素的微氣泡作為分子探針，基于BirA 及其受體肽的報告基因有望對其他深層組織中的生物學(xué)過程進(jìn)行研究。

三、報告基因在體內(nèi)外超聲成像中的應(yīng)用

1.聲學(xué)報告基因（ARGs）和哺乳動物聲學(xué)報告基因（mARGs）：Bourdeau 等［17］報道了一種重組gvp 基因作為ARGs，命名為ARG1。由于單獨將水華魚腥藻和鹽生桿菌NRC-1 的gvp 基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌工程菌中并不會產(chǎn)生GVs，而巨大芽孢桿菌gvp 基因轉(zhuǎn)入后雖然能產(chǎn)生GVs，但無明顯的超聲造影效果。因此，Bourdeau 等［17］選擇將水華魚腥藻GVs 的結(jié)構(gòu)蛋白基因與巨大芽孢桿菌GVs 進(jìn)行基因重組，并導(dǎo)入大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中，于透射電鏡下觀察到菌體內(nèi)存在大量氣泡狀結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的超聲對比度。隨后，重組有ARG1 和luxABCDE（Lux）的大腸桿菌EcN 被用于聲學(xué)和光學(xué)報告基因?qū)φＰ∈蠼Y(jié)腸組織成像能力的對比，相較于光學(xué)報告基因僅能顯示組織的大致范圍，ARGs 能更清晰地通過大腸桿菌EcN 顯示結(jié)腸組織的結(jié)構(gòu)，檢測深度＞10 cm，分辨率＜100 μm。腫瘤內(nèi)部的缺氧環(huán)境可為鼠傷寒沙門氏菌等厭氧菌的定殖提供條件，目前已有利用該類細(xì)菌診斷和治療癌癥的研究［18］，但由于成像深度的限制，光學(xué)成像無法對細(xì)菌療法的效果進(jìn)行全面評估。因此，重組攜ARG1的鼠傷寒沙門氏菌被進(jìn)一步用于對荷瘤小鼠腫瘤組織的超聲成像，結(jié)果顯示ARG1 作為聲學(xué)報告基因提供了高分辨率的超聲圖像，證實了其深部無創(chuàng)成像性能。

真核生物的基因調(diào)控方式與原核生物不同，將ARGs 作為報告基因轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控過程更為復(fù)雜。Farhadi等［19］報道了基于ARGs的mARGs，mARGs是由多質(zhì)粒組成的共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，包括gvpB 重組質(zhì)粒、病毒P2A 序列連接的多個巨大芽孢桿菌gvp 重組質(zhì)粒及增強(qiáng)質(zhì)粒，并在其中設(shè)計了由強(qiáng)力霉素控制的基因表達(dá)開關(guān)。多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 人體腎臟細(xì)胞，經(jīng)純化分離后電鏡下可見中空蛋白結(jié)構(gòu)。體內(nèi)實驗顯示，向免疫缺陷小鼠左右腿分別注射具有致瘤性的mARGHEK 和mCherry-HEK 細(xì)胞，構(gòu)建了一種雙側(cè)荷瘤模型。由于腫瘤外側(cè)的新生血管多，外部血供較內(nèi)部豐富，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)劑更多地富集在腫瘤組織外側(cè)，產(chǎn)生了較強(qiáng)的聲學(xué)報告基因誘導(dǎo)作用。超聲成像下，報告基因的信號可以清晰并動態(tài)地勾勒出腫瘤組織的輪廓，而另一側(cè)腫瘤組織中的光學(xué)報告基因雖持續(xù)表達(dá)，但僅能顯示出斑點狀的腫瘤輪廓。

2.Biotag-BirA 報告系統(tǒng)：Bartelle等［10］構(gòu)建了一種基于BirA及其受體肽的Biotag 基因報告系統(tǒng)，主要基因元件包括Tie2 血管啟動子、BAP融合蛋白序列及BirA 序列。該基因報告系統(tǒng)轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可在細(xì)胞表面展示生物素。同時，Tie2 血管啟動子的存在使生物素的表達(dá)量隨血管生長發(fā)育狀態(tài)改變［20］。在超聲作用下，與細(xì)胞表面生物素結(jié)合的親和素功能化微氣泡分子探針能夠產(chǎn)生穿透深度較深、與生物素表達(dá)量呈線性關(guān)系的超聲信號。Bartelle等［10］先向HEK-293細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向BirA和BAP 融合蛋白重組質(zhì)粒，將生物素蛋白展示在細(xì)胞表面，并在體外實驗中驗證了報告系統(tǒng)表達(dá)的可行性。體內(nèi)實驗中，用Biotag 報告系統(tǒng)構(gòu)建了Ts-Biotag 轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型，隨著轉(zhuǎn)基因小鼠的血管發(fā)育，Tie2 血管啟動子控制著血管內(nèi)皮細(xì)胞表面生物素的表達(dá)，向轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)注射微氣泡分子探針后，探針結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，根據(jù)超聲信號的強(qiáng)弱可監(jiān)測小鼠血管生長發(fā)育的動態(tài)超聲圖像。因此，BirA 及其受體肽作為一種間接的超聲成像報告基因系統(tǒng)為研究血管系統(tǒng)發(fā)育過程提供了新方式，并有望實現(xiàn)對其他深層組織中生物學(xué)過程的研究。

四、結(jié)論與展望

報告基因顯像使在分子水平動態(tài)無創(chuàng)觀察細(xì)胞動態(tài)活動成為可能。超聲波是一種廣泛使用的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，可實現(xiàn)具有高時空分辨率的無創(chuàng)成像。目前，多數(shù)超聲成像報告基因系統(tǒng)均與微氣泡有關(guān)，由偽空胞衍生出的ARGs 和mARGs 實現(xiàn)了動物模型的結(jié)腸組織和腫瘤組織的高分辨超聲成像?；蚓幋a產(chǎn)生的生物源性微氣泡在尺寸、穩(wěn)定性及抗壓性等方面均顯示出了優(yōu)越性。BirA 及其受體肽作為間接的超聲成像報告基因系統(tǒng)，以偶聯(lián)親和素的第三代微氣泡作為分子探針，被用于動物模型炎癥部位和血管發(fā)育的監(jiān)測與分析，具有良好的應(yīng)用前景。此外，雖然過氧化氫酶等氣體產(chǎn)生酶生成的氣泡在物理性質(zhì)上不夠穩(wěn)定，僅能維持?jǐn)?shù)分鐘，但也可進(jìn)行短時間的超聲成像，有望被開發(fā)為新型超聲成像報告基因［21］。

已開發(fā)的超聲成像報告基因也存在不足：①已開發(fā)的超聲成像報告基因數(shù)量不多，其是否能在體內(nèi)復(fù)雜多變的微環(huán)境中應(yīng)用尚有待探索；②報告基因往往作為一種外源性基因?qū)?，生物安全性需進(jìn)一步驗證；③報告基因編碼產(chǎn)物的定量方法尚不成熟，標(biāo)準(zhǔn)化研究亟待探索。隨著超聲分子影像學(xué)的發(fā)展，報告基因種類的增多，相信超聲報告基因?qū)⑦M(jìn)一步推動超聲分子影像領(lǐng)域發(fā)展并煥發(fā)新的活力。