崔慶鵬 劉孝東 范世成 朱元全 羅云 羅鈺輝

1云南省第三人民醫(yī)院泌尿外科（昆明650000）；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明650032）

泌尿系結(jié)石又稱為尿石癥，是一種古老的疾病。在不同的國(guó)家，不同的地區(qū)發(fā)病率不一，在歐美國(guó)家，其發(fā)病率為2%～19%［1］；在我則為為1%～5%，而我國(guó)云南及其他西南地區(qū)發(fā)病率更高達(dá)5%～10%［2］。泌尿系結(jié)石的病因復(fù)雜，多種因素與泌尿系結(jié)石的形成相關(guān)，代謝異常被認(rèn)為是最重要的因素之一［2］。目前普遍認(rèn)為代謝異常是泌尿系原發(fā)結(jié)石最主要的病因。而在含鈣泌尿系結(jié)石患者中，特發(fā)性高鈣尿癥是最常見(jiàn)的［3］。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaR/CaSR）被認(rèn)為在特發(fā)性高鈣尿癥的形成中扮演了重要角色。表達(dá)于腎臟的緊密連接蛋白14（the tight junction protein claudin-14，CLDN14），在尿Ca2+的排泄中具有重要意義，而CLDN14 受到CaSR 的調(diào)節(jié)，激活的CaSR 上調(diào)CLDN14 的表達(dá)，導(dǎo)致尿鈣增加，形成含鈣泌尿系結(jié)石［4］。但目前關(guān)于CaSR 在特發(fā)性高鈣尿癥中的作用機(jī)制并不完全清楚。我們通過(guò)建立遺傳高鈣尿結(jié)石形成大鼠（genetic hypercalciuric stones forming rats，GHS）模型，對(duì)大鼠進(jìn)行CaSRmiRNA 慢病毒干擾，通過(guò)檢測(cè)CLDN14 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平以及24 h 尿鈣的排泄量，來(lái)研究CaSR 與特發(fā)性高鈣尿癥的關(guān)系，為泌尿系結(jié)石的藥物預(yù)防及治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料雄性并且性成熟的健康SD大鼠；shRNA載體；Lipofectamine2000、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、T4DNA 連接酶、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)、限制性內(nèi)切酶XholⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NRK-52E 細(xì)胞、兔抗大鼠CaSR 多克隆抗體、慢病毒、質(zhì)粒DNA 小量試劑盒、RNA 提取試劑、RNase-free DNaseⅠ試劑盒、RIPA 細(xì)胞總蛋白提取液、大腸桿菌菌株DH5α、Trizol PCR 試劑盒、ECL 試劑盒、第1鏈cDNA 合成試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 GHS 大鼠模型的建立通過(guò)選擇尿鈣最高的近親雌雄大鼠反復(fù)傳代［5］，培育出了GHS 大鼠模型。一般認(rèn)為大鼠尿鈣值＞1.5 mg/24 h，高于對(duì)照組大鼠尿鈣排泄平均值兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為大鼠高尿鈣的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 CaSR-miRNA 慢病毒載體的制備本實(shí)驗(yàn)組前期已完成，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.3 動(dòng)物分組及體及病毒體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)雄性GHS大鼠和雄性正常尿鈣對(duì)照組大鼠（Normal control rats，NC）各20只，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡2～3 個(gè)月，隨機(jī)分為5 組，每組4 只，第1～4 組采用干擾病毒進(jìn)行體內(nèi)干擾作為實(shí)驗(yàn)組，第5 組采用等量0.9%氯化鈉溶液干預(yù)作為對(duì)照組。慢病毒載體通過(guò)外科手術(shù)從大鼠腎靜脈注入腎臟內(nèi)。在注射病毒后3、7、14、21 d 分別處死實(shí)驗(yàn)組大鼠，取雙腎；留作PCR 及WB 標(biāo)本。于病毒干擾后21 d 時(shí)處死對(duì)照組大鼠并留取標(biāo)本。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀在處死大鼠前測(cè)定各組大鼠的2 個(gè)24 h 尿鈣排泄?jié)舛龋⒂?jì)算24 h 的尿鈣排泄量。

1.2.4 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿鈣濃度

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)各組腎臟組織樣本按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，反應(yīng)液的配制：2×Premix SYBR Green Ⅰ10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，10 μmol/μL 的上、下游引物各0.4 μL，共40 個(gè)循環(huán)（以上操作在冰上進(jìn)行）。結(jié)果以GAPDH 的Ct 值作內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行樣本分析。PCR 引物如下所示（表1）。

表1 PCR 引物表格Tab.1 PCR primer table

1.2.6 Western 印跡提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDSPAGE 電泳，后行PVDF 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。在室溫下用TBST 溶液洗脫適量一抗三次，每次10 min。室溫孵育按1∶3 000 稀釋的二抗30 min，并用TBST 洗脫三次，每次10 min。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，目標(biāo)帶的光密度值采用imageJ 軟件進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism6.0進(jìn)行。多組計(jì)量資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行，兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GHS大鼠模型的成功建立通過(guò)選擇尿鈣最高的近親雌雄大鼠反復(fù)傳代的方法在第六代時(shí)成功建立了CHS大鼠模型。第6代GHS大鼠組中88.2%（15/17）的雄性大鼠和94.1%（16/17）的雌性大鼠尿鈣高于1.5 mg/24 h。其24 h尿鈣排泄量見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠的尿鈣排泄量Tab.2 Urinary calcium excretion of rats in each group ±s

表2 各組大鼠的尿鈣排泄量Tab.2 Urinary calcium excretion of rats in each group ±s

注：F 組間=77.245，P 組間＜0.001；PGHS1 與NC1＜0.001；PGHS1 與NC2＜0.001；PGHS1與GHS2=0.789；PNC1與GHS2＜0.001；PNC1與NC2=0.799；PGHS2與NC2＜0.001

組別GSH 雄性組NC 雄性組GSH 雌性組NC 雌性組例數(shù)15 15 16 16尿鈣值（mg/24 h）2.784±0.594 1.074±0.162 2.742±0.590 1.114±0.138

2.2 腎臟組織CaSR-miRNA 慢病毒干擾后對(duì)大鼠尿鈣排泄的影響慢病毒干擾后，與對(duì)照組相比：GHS 實(shí)驗(yàn)組大鼠尿鈣排泄量下降（圖1）；NC 實(shí)驗(yàn)組大鼠尿鈣排泄量稍有減少，但對(duì)比NC 對(duì)照組大鼠無(wú)明顯變化（圖2）。

圖1 GHS 實(shí)驗(yàn)組大鼠尿鈣比較圖Fig.1 Comparison of urinary calcium in rats in GHS group

圖2 NC 實(shí)驗(yàn)組大鼠尿鈣比較圖Fig.2 Comparison of urinary calcium in the NC experimental group

2.3 Real-timePCR 檢測(cè)GHS 組和NC 組大鼠CLDN14 不同時(shí)段mRNA 表達(dá)水平慢病毒干擾后，CHS 組CLDN14 mRNA 表達(dá)水平下降，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，NC 組CLDN14 mRNA 表達(dá)水平較變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 干擾后GHS 組與NC 組大鼠CLDN14 基因的mRNA表達(dá)水平圖Fig.3 mRNA expression levels of CLDN14 gene in GHS group and NC group after interference

2.4 Western blot檢測(cè)CLDN14的蛋白表達(dá)GHS組與NC組上CLDN14 蛋白質(zhì)表達(dá)圖（以β-actin 為內(nèi)參，以各條帶control 組為校準(zhǔn)）見(jiàn)圖4、5。其灰度值統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖6。

圖4 GHS 組大鼠鈣CLDN14 的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of calcium CLDN14 protein expression in rats in GHS group

圖5 NC 組大鼠鈣CLDN14 的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of calcium CLDN14 protein expression in NC group

圖6 干擾后GHS 組與NC 組大鼠CLDN14 蛋白的表達(dá)水平變化圖Fig.6 Changes in the expression levels of CLDN14 protein in GHS group and NC group after interference

3 討論

GHS 大鼠動(dòng)物模型是由BUSHINSKY 等學(xué)者于20世紀(jì)首先培育出的，該動(dòng)物模型自被培育出以后就引起了人們足夠的重視。筆者按照前人的方法，成功建立了GHS大鼠模型。通常認(rèn)為大鼠尿鈣值＞1.5 mg/24 h，高于對(duì)照組大鼠尿鈣排泄平均值兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為大鼠高尿鈣的標(biāo)準(zhǔn)。在第六代模型鼠中，17只雄性大鼠中15只達(dá)到高尿鈣標(biāo)準(zhǔn)，其24 h 尿鈣分別為（2.78±0.59）mg/24 h；17 只雌性大鼠中16 只達(dá)到高尿鈣標(biāo)準(zhǔn)，（2.74±0.59）mg/24 h。而正常尿鈣對(duì)照組大鼠雄性及雌性大鼠的24 h尿鈣排泄量分別為（1.07±0.16）mg/24 h 和（1.11±0.14）mg/24 h，因此本研究成功的建立了GHS 大鼠動(dòng)物模型。

1933年BROWN等［7］第一次在牛甲狀旁腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了CaSR，人們就對(duì)這對(duì)其產(chǎn)生了足夠的興趣，進(jìn)行了一系列的研究。LIU 等［8］研究表明CaSR基因位于人類3號(hào)染色體上，由7個(gè)外顯子，兩個(gè)啟動(dòng)子組成，共1 078 個(gè)氨基酸殘基，是G 蛋白偶聯(lián)受體家族的一員。維生素D3 可通過(guò)調(diào)控其兩個(gè)啟動(dòng)子來(lái)促進(jìn)其表達(dá)。CaSR 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由TENNAKOON 等［9］闡明，一是胞膜外親水性的胞外區(qū)氨基結(jié)構(gòu)域（extracellular N terminal domain，ECD），作用是與相關(guān)配體結(jié)合；二是胞膜上跨膜區(qū)域（transmembrane domain，TMD）是G蛋白偶聯(lián)受體家族的特征性結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵位置；最后是胞內(nèi)羧基結(jié)構(gòu)域（intercellular domain，ICD），是蛋白激酶磷酸化的區(qū)域。3 個(gè)區(qū)域構(gòu)成典型的G 蛋白偶聯(lián)受體通道，在細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起到了重要作用。母目前的研究發(fā)現(xiàn)CaSR 不僅表達(dá)于甲狀旁腺，還廣泛表達(dá)于腎臟、骨、胃腸道等組織，可感染細(xì)胞外的Ca2+變化，在體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)方面起到了十分重要的作用［10-11］。

筆者通過(guò)對(duì)GHS組大鼠及NC組大鼠進(jìn)行CaSRmiRNA 慢病毒體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，GHS 組大鼠的尿鈣排泄量在干擾后的第3～21天下降明顯，而在NC 組大鼠中卻未發(fā)現(xiàn)尿鈣排泄量有下降。這一現(xiàn)象說(shuō)明了GHS 大鼠可能高表達(dá)CaSR，而過(guò)高表達(dá)的CaSR 可能引起大鼠發(fā)生高鈣尿癥。王少剛［12］、李朋［13］等的研究團(tuán)隊(duì)也成功培育GHS 大鼠模型，他們的研究均表明CaSR 在GHS鼠腎臟高表達(dá)，在NC 組大鼠腎臟低表達(dá)。因此NC 組大鼠慢病毒干擾后尿鈣排泄值變化不大，這是由于NC 組大鼠低表達(dá)CaSR，CaSR-miRNA 慢病毒體內(nèi)干擾后沒(méi)有產(chǎn)生足夠的CaSR 基因沉默，不足以引起NC 組大鼠24 h 尿鈣排泄值產(chǎn)生變化。

目前，研究［12-13］還表明GHS大鼠腎臟組織CaSR的表達(dá)過(guò)高可能與大鼠的高鈣尿癥相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，CaSR 可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管CLDN14的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)腎臟對(duì)尿鈣的重吸收。

CLDN14 廣泛表達(dá)于髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）中，對(duì)尿鈣在TAL 中的重吸收起到了十分重要的作用［14］。CLDN14 是一種膜蛋白，在上皮細(xì)胞緊密連接處細(xì)胞旁離子和小的溶質(zhì)的通透性方面有重要作用［15］。DIMKE 等［16］研究發(fā)現(xiàn)：在通常情況下，腎臟組織中CLDN14 基因是低表達(dá)的。此時(shí)細(xì)胞旁離子和小溶質(zhì)有較強(qiáng)的通過(guò)性。而當(dāng)CaSR 被激活后，腎臟CLDN14 基因表達(dá)增強(qiáng)，降低了此種通過(guò)性。他的實(shí)驗(yàn)還說(shuō)明高Ca2+飲食會(huì)增加腎臟CLDN14 表達(dá)，低Ca2+或正常飲食時(shí)，腎臟CLDN14 表達(dá)不變，這表明Ca2+可能是CLDN14 表達(dá)的激活物。使用西那卡塞（一種擬鈣劑），可以增加CaSR對(duì)Ca2+的敏感性，促使CLDN14表達(dá)量提高了40 倍。過(guò)度表達(dá)的CLDN14 會(huì)增加細(xì)胞間抵抗性，使細(xì)胞間的連接更加密集，降低了細(xì)胞旁Ca2+的通過(guò)量。以上研究結(jié)果說(shuō)明了過(guò)多的游離Ca2+通過(guò)激活CaSR 正向調(diào)節(jié)CLDN14 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致尿液中Ca2+的重吸收減少，導(dǎo)致了原發(fā)性泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生。CaSR 對(duì)CLDN14 的調(diào)控過(guò)程可能是通過(guò)CLDN14表達(dá)miRNAs而受到CaSR的調(diào)控［17-18］。在小鼠中，激活的CaSR通過(guò)活化T細(xì)胞 的 核 因 子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）介導(dǎo)的抑制微小RNA（miR9 和miR374）的組蛋白脫乙?；磉_(dá)機(jī)制來(lái)調(diào)控CLDN14 的轉(zhuǎn)錄［17-20］。本研究表明與對(duì)照組相比，病毒體內(nèi)干擾后，GHS 組大鼠CLDN14mRNA 和蛋白表達(dá)量減少，NC 組大鼠CLDN14mRNA 和蛋白表達(dá)量則無(wú)明顯變化。說(shuō)明在GHS 大鼠組中高表達(dá)的CaSR 正向調(diào)控了CLDN14 基因的表達(dá)，這一調(diào)控機(jī)制在NC組中則不明顯。

綜上所述，CaSR 對(duì)尿鈣重吸收的影響可能是通過(guò)對(duì)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白CLDN14 的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CaSR 的過(guò)度激活可能導(dǎo)致高鈣尿癥的發(fā)生，尿中過(guò)多的Ca2+沉積導(dǎo)致了原發(fā)性含鈣尿結(jié)石的產(chǎn)生。CaSR 可能成為泌尿系結(jié)石預(yù)防與治療的一個(gè)藥物靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)未敲除CLDN14 基因，尚不能完全證明上述結(jié)論，在接下來(lái)的研究中，筆者將敲除CLDN14 基因，控制特異性。同時(shí)，我們將增強(qiáng)CaSR 的表達(dá)，探究在CaSR 激活后，大鼠腎臟CLDN14 mRNA 及蛋白表達(dá)情況及尿鈣排泄情況，來(lái)進(jìn)一步研究CaSR 在高鈣尿癥及泌尿系結(jié)石中的作用機(jī)制。