王 博，楊澤健，張 妙，田碧霞，宋少苒，孫 偉，高小倩，周 燦，劉培軍

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤精準醫(yī)學重點實驗室，陜西西安 710061；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，陜西西安 710061)

Rb基因即視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(retinoblastoma gene)，是發(fā)現(xiàn)最早、并被鑒定出的抑癌基因。Rb基因的突變可導致眼部惡性視網(wǎng)膜母細胞瘤，在隨后的研究中不斷地發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤組織中常處于突變狀態(tài)，包括常見的小細胞肺癌、乳腺癌以及視網(wǎng)膜母細胞瘤等[1-2]。Rb蛋白主要通過參與細胞周期的調(diào)控從而發(fā)揮其抑癌作用[3]，但其功能的失活將影響細胞周期的調(diào)控，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。盡管如此，但Rb在癌癥中持續(xù)性丟失的分子和細胞基礎仍不十分清楚[4]。因此，構建一種易于檢測的報告基因系統(tǒng)對于研究Rb基因與腫瘤發(fā)生的關系和篩選靶向治療藥物具有重要意義。

報告基因(reporter gene)是一類可以編碼熒光蛋白或酶，從而將看不見的底物轉化為發(fā)光或彩色產(chǎn)物的一類基因，是生物醫(yī)學領域基礎研究的一個重要工具，廣泛應用于檢測細胞的信號轉導和基因表達。通過在報告基因上附加元件來調(diào)節(jié)報告基因的活性，利用光學成像技術實時報告其表達的位置或水平，使了解疾病的分子基礎和體外藥物研發(fā)成為可能[5]。本實驗選擇以熒光素酶作為報告基因構建Rb檢測系統(tǒng)，為深入研究腫瘤的發(fā)生機制，促進腫瘤的靶向治療研究提供有效工具。

本研究通過經(jīng)典的分子克隆技術，構建出含有特異性Rb反應元件的Rb報告基因載體，使其轉染HEK293細胞并篩選穩(wěn)定表達Rb的單克隆細胞株，最終在該報告基因檢測系統(tǒng)中通過監(jiān)測Rb的激活和抑制作用評估該系統(tǒng)的檢驗效能，為Rb基因表達產(chǎn)物的活性檢測提供可靠的依據(jù)，也為Rb基因異常的靶向治療研究和療效評估提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料基因序列合成Rb反應元件(擎科生物科技有限公司)；高速高保真PCR酶(TaKaRa公司)；XhoⅠ、HindⅢ內(nèi)切酶(NEB公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和E.coliDH5α宿主菌(天根生化科技有限公司)；pGL6-TA報告基因載體(碧云天生物技術有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(康寧公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；X-tremeGENE HP轉染試劑(Roche公司)；T4連接酶、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)；CDK4/6抑制劑Palbociclib(Selleck公司)。人腎上皮細胞系HEK293由西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心進行保種。

1.2 報告基因pGL6-Rb-Luc載體的構建按照經(jīng)典的分子克隆方法，將Rb反應元件克隆到報告基因載體中，形成Rb熒光素酶報告基因載體，該載體具體結構見圖1。將Rb反應元件序列通過PCR儀緩慢降溫，最終退火形成具有黏性末端的雙鏈DNA序列(表1)。PCR儀退火程序的反應體系：Rb反應元件上游序列和下游序列各2 μL，5 ×Annealing Buffer 10 μL，ddH2O 36 μL；PCR儀中緩慢降溫進行退火程序。從菌液中提取報告基因pGL6-TA質(zhì)粒，再通過XhoⅠ和HindⅢ 37 ℃雙酶切2 h，凝膠電泳后膠回收純化載體pGL6-TA的雙酶切產(chǎn)物。使用T4連接酶將雙酶切產(chǎn)物和退火產(chǎn)物進行DNA連接，再運用熱激法將上述連接產(chǎn)物轉化E.coliDH5α感受態(tài)，37 ℃培養(yǎng)1 h后涂布LB平板(氨芐青霉素Amp抗性)，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，其中需要分別設置ddH2O為陰性對照組以及對照質(zhì)粒pUC19為陽性對照組。次日觀察單克隆菌落生長情況，挑單克隆并進行液體培養(yǎng)擴增。對液體培養(yǎng)起來的菌液再進行菌液PCR鑒定，鑒定上游引物5′-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3′，下游引物5′-CCCGCGCGCCACCCCTC-TGGCGCCACCGTG-3′。對菌液PCR鑒定陽性克隆，送其質(zhì)粒至測序公司進行鑒定，測序結果進行比對后命名比對序列完全正確的載體為pGL6-Rb-Luc。

表1 Rb反應元件和TA啟動子序列

1.3 質(zhì)粒pGL6-Rb-Luc轉染HEK293細胞將pGT6-TA和pGL6-Rb-Luc菌液進行擴大培養(yǎng)，分別提取無內(nèi)毒素的對照載體pGT6-TA和Rb報告基因載體pGL6-Rb-Luc。將人腎上皮HEK293細胞按照合適的密度接種于細胞培養(yǎng)6孔板中，并使用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。接種細胞24 h后，將X-tremeGENE HP轉染試劑分別與質(zhì)粒pGT6-TA和pGL6-Rb-Luc進行混合，靜置后分別轉染HEK293細胞。

1.4 Rb報告基因穩(wěn)定表達單克隆細胞株的篩選細胞轉染48 h后，加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的遺傳霉素對細胞進行抗性篩選，要求每2 d換1次新鮮的抗性培養(yǎng)基，并持續(xù)篩選2周以上以便得到穩(wěn)定表達的單克隆細胞。將該部分混合克隆進行細胞消化，通過分選型流式細胞儀分選單細胞并正?？剐耘囵B(yǎng)，對生長起來的單克隆細胞隨后進行正常傳代、擴大培養(yǎng)，并命名穩(wěn)定表達對照質(zhì)粒pGT6-TA的單克隆細胞株為HEK293-Luc，穩(wěn)定表達Rb報告基因質(zhì)粒pGL6-Rb-Luc的單克隆細胞株為HEK293-Rb-Luc。

1.5 報告基因細胞株HEK293-Rb-Luc激活作用的檢測將上述構建好的對照細胞株HEK293-Luc和報告基因細胞株HEK293-Rb-Luc細胞消化后，分別細胞計數(shù)并按相同細胞密度接種96孔板。待孔板中細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。隨后添加胎牛血清進行血清刺激培養(yǎng)，分別在0、6、12、24 h不同時間點，檢測相對應的熒光素酶發(fā)光值，并設置5個復孔/組。

1.6 報告基因細胞株HEK293-Rb-Luc抑制作用的檢測按照上述同樣的條件和方法接種細胞，接種24 h后撤除血清饑餓培養(yǎng)24 h。隨后同時加入血清和濃度分別為0、25、50、75和100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib[6]共同刺激細胞12 h，按照上述相同的方法檢測發(fā)光值，并設置5個復孔/組。

1.7 統(tǒng)計學分析使用SPSS 23.0統(tǒng)計學分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD(t)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 構建Rb報告基因載體pGL6-Rb-Luc將退火反應后雙鏈具有黏性末端的Rb反應元件連接至雙酶切報告基因pGL6 -TA載體多克隆位點區(qū)，轉化感受態(tài)細胞后挑取單克隆進行培養(yǎng)，對挑取的每個菌液進行菌液PCR鑒定。PCR反應后產(chǎn)物通過15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物大小為153 bp，與理論插入Rb反應元件序列大小相同(圖2)。將菌液PCR鑒定陽性的菌液送公司進行測序分析，再將測序結果通過在線的BLAST(NCBI)進行比對，比對結果表明陽性克隆插入序列與Rb反應元件序列相一致，故已成功構建Rb報告基因載體pGL6-Rb-Luc。

圖2 報告基因載體pGL6-Rb-Luc的菌液PCR鑒定結果

2.2 構建Rb報告基因穩(wěn)定表達單克隆細胞株HEK293-Rb-Luc將報告基因對照載體pGL6-TA和Rb報告基因載體pGL6-Rb-Luc分別轉染HEK293細胞，再通過G418抗性篩選以及流式細胞儀分選單細胞培養(yǎng)，故已獲得穩(wěn)定表達報告基因的對照單克隆細胞株HEK293-Luc以及穩(wěn)定表達Rb報告基因的單克隆細胞株HEK293-Rb-Luc。先將這兩株單克隆細胞株撤除血清饑餓處理，再回補血清進行刺激，在不同時間點分別檢測熒光素酶的活性。結果顯示，恢復血清培養(yǎng)6、12、24 h后HEK293-Rb-Luc細胞中熒光素酶的活性顯著升高，相比于0 h的HEK293-Rb-Luc組熒光素酶活性分別升高了5.2、18.9和9.8倍，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖3)。

圖3 血清刺激不同時間點對HEK293-Rb-Luc單克隆細胞的作用

而對照細胞HEK293-Luc在血清刺激后的6、12、24 h，熒光素酶活性與0 h相比無顯著性變化，即組間無統(tǒng)計學差異。該結果說明構建的HEK293-Rb-Luc可以有效的檢測Rb活化，故已成功篩選出檢測Rb活化的熒光素酶報告基因系統(tǒng)。

2.3 驗證Rb熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測能力使用CDK4/6抑制劑Palbociclib檢驗Rb熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測能力，將HEK293-Rb-Luc細胞株撤除血清處理24 h后,再加入血清和0、25、50、75、100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib后共同培養(yǎng)12 h檢測相應的熒光素酶活性。結果顯示，與未加血清組相比，恢復血清培養(yǎng)后各組的熒光素酶活性顯著升高，其中加入0 nmol/L CDK4/6抑制劑Palbociclib組的熒光素酶活性升高20.1倍；在同時添加血清和CDK4/6抑制劑Palbociclib的幾組中，相比于0 nmol/L Palbociclib組，其余各組熒光素酶的活性均顯著降低，Rb活性的抑制率在25 nmol/L Palbociclib組為6.90%，在50 nmol/L Palbociclib組為40.23%，在75 nmol/LPalbociclib組為50.57%，在100 nmol/L Palbociclib組為62.07%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.001，圖4)。通過檢測恢復血清對HEK293-Rb-Luc細胞株Rb基因的激活作用和CDK4/6抑制劑Palbociclib對Rb基因的抑制作用，結果說明已構建的Rb熒光素酶報告基因系統(tǒng)HEK293-Rb-Luc細胞株可以精準、有效地檢測Rb活性從而反映Rb活化程度。

圖4 CDK4/6抑制劑Palbociclib對HEK293-Rb-Luc單克隆細胞株的抑制作用

3 討 論

細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)是磷酸化Rb蛋白的主要激酶，在細胞G1末期細胞周期蛋白介導CDK與Rb蛋白三者相互作用形成復合物，進而讓CDK磷酸化Rb蛋白，使得Rb蛋白釋放轉錄因子E2F；E2F進入細胞核后，可以轉錄激活一系列周期相關蛋白的表達，包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)、胸苷激酶(thymidine kinase, TK)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)、DNA聚合酶α(DNA polymerase, POL)、CDC2、cyclin E、cyclin A和E2F1等，這些周期相關蛋白的表達使得細胞從G1期移型至S期[4,7]。Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)一直維持到細胞完成分裂并進入到下一個細胞周期時，Rb再次去磷酸化并結合到E2F上[8]。同時，Rb蛋白還可以通過參與p16/Rb信號通路誘導細胞老化現(xiàn)象，是因為P16INK4A通過抑制CDK4/6對Rb蛋白的磷酸化，使得E2F和Rb蛋白結合無法入核發(fā)揮其功能，最終阻止細胞進入S期，進而導致細胞的老化[9]。但目前關于Rb的活性形式仍然存在一些爭議。DOWDY等[10]發(fā)現(xiàn)，Rb在G1早期被cyclin D和CDK4/6單磷酸化，表現(xiàn)出優(yōu)先的E2F結合模式，但在G1晚期，cyclin E和CDK2通過磷酸化使Rb失活，發(fā)生DNA損傷反應的細胞激活cyclin D和Cdk4/6，產(chǎn)生單磷酸化Rb，調(diào)控全局轉錄，而分化的細胞則利用未磷酸化的Rb。

特異性分子靶向藥物具有治療靶點明確，治療效果明確以及對正常組織損傷較小等特點，故近年來被廣泛應用到腫瘤臨床治療中[11]。Rb通路與癌癥發(fā)展之間的密切聯(lián)系表明，Rb活性狀態(tài)的調(diào)控可能被用于開發(fā)靶向治療[12]。較多的研究發(fā)現(xiàn)在幾乎所有惡性腫瘤中CDK-Rb-E2F通路都發(fā)現(xiàn)了顯著的變化，目前最新的CDK4/6抑制劑可使細胞周期恢復正常，并在治療雌激素受體陽性乳腺癌中得到了很好地應用[4,13]。然而，導致臨床上部分患者對CDK4/6抑制劑耐藥的因素尚不清楚。CONDORELLI等[14]研究中發(fā)現(xiàn)，轉移性乳腺癌患者暴露于帕博西林或瑞博西林后反而出現(xiàn)了Rb基因的突變，但這些突變是如何在CDK4/6抑制劑的選擇壓力下出現(xiàn)的仍有待進一步研究。腫瘤對靶向藥物的耐藥性也可能與非典型的Rb通路有關[12,15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Rb重新激活讓晚期腫瘤經(jīng)重編程后轉向轉移能力較弱的細胞狀態(tài)，但是由于MAPK通路信號轉導的適應性重新連接而不能夠阻止癌細胞增殖和腫瘤生長[3]。生物體內(nèi)的信號轉導是一個復雜的聯(lián)動過程，分子靶向治療在關注某一生物分子的靶向作用時，容易因忽視整個機體對藥物的反應而產(chǎn)生更多的不良反應[16]。

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中Rb及其相關通路尚不完全明晰、分子靶向治療依然存在的缺陷，都使得探明腫瘤的發(fā)生機制、尋找更精準有效的治療方法顯得尤為重要。而報告基因作為生物醫(yī)學領域基礎研究的常用工具，也是有效靶點前期篩選的重要步驟。目前常見的熒光素酶、各種不同顏色的熒光蛋白以及β半乳糖苷酶等報告基因應用最為廣泛，而其中熒光素酶報告基因相比其他報告基因具有靈敏度高、檢測效率高、操作方便等優(yōu)勢[17]。

本研究通過構建帶有Rb反應元件序列的報告基因載體pGL6-Rb-Luc，轉染HEK293細胞后，通過G418抗性篩選出穩(wěn)定表達Rb報告基因的單克隆細胞株HEK293-Rb-Luc，并使用血清刺激和CDK4/6抑制劑Palbociclib檢驗HEK293-Rb-Luc的激活和抑制作用。相比于0 h，恢復血清培養(yǎng)6、12、24 h后HEK293-Rb-Luc細胞中熒光素酶的活性分別升高了5.2、18.9和9.8倍。相比于0 nmol/L Palbociclib組，25、50、75和100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib使Rb活性的抑制率分別達到6.90%、40.23%、50.57%和52.07%。因此，本研究已成功構建并篩選出Rb熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)HEK293-Rb-Luc，且能夠高效特異地檢測Rb的活化水平。