宋吉哲 劉成林 杜愛玲

1濰坊醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室（山東濰坊261000）；2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（山東濰坊261031）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)生后，梗死區(qū)域隨即出現(xiàn)中性粒細(xì)胞滲入，之后便有單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，并在AMI 后的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞中M2 亞型巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生抗炎調(diào)節(jié)因子（IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等）在炎癥的消退、組織重塑過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-3］。而糖皮質(zhì)激素在慢性阻塞性肺疾病等炎癥性疾病和風(fēng)濕性疾病治療中有著無(wú)法代替的地位［4］，恰恰這部分患者往往具有冠心病危險(xiǎn)因素的存在，極易誘發(fā)急性心肌梗死。有研究表明，糖皮質(zhì)激素能夠抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，并使其促炎性細(xì)胞因子分泌減少，在炎癥消退中發(fā)揮重要作用［5-8］。特別是對(duì)于需要臨床常規(guī)應(yīng)用激素治療但又罹患AMI 的患者來(lái)說(shuō)，糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用是非常必要的，但是糖皮質(zhì)激素對(duì)于AMI 的影響卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)大鼠建立AMI 模型，探討地塞米松對(duì)AMI 的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器Vivid E9 彩色多普勒超聲診斷儀（美國(guó)GE 公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國(guó)AppliedBiosystems 公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司），One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組44只雄性SD大鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK 魯20190003），體質(zhì)量220～250 g，采用隨機(jī)等間隔抽樣法抽取8 只為假手術(shù)組，其他36 只大鼠采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立AMI 模型，將術(shù)后24 h 建模成功存活的19 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10 只和實(shí)驗(yàn)組9 只。實(shí)驗(yàn)組大鼠于模型建立后24 h 給予地塞米松1 mg/kg 肌肉注射1 次，假手術(shù)組及對(duì)照組大鼠于術(shù)后24 h 給予0.2 mL/kg 等容生理鹽水肌肉注射。該研究得到了濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.3 大鼠AMI 模型的建立實(shí)驗(yàn)大鼠的麻醉采用腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），將成功麻醉后的SD 大鼠取其仰臥位固定到操作臺(tái)上，經(jīng)口腔進(jìn)行氣管插管，成功后連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)上，呼吸機(jī)設(shè)定：呼吸頻率設(shè)置為60 次/min，潮氣量設(shè)置為3 mL/l00 g，呼吸時(shí)比設(shè)置為3∶2。選取大鼠3、4 肋間胸骨左緣0.5 cm 處為手術(shù)切口，予以剪毛備皮后碘伏消毒，切開皮膚后鈍性分離，暴露出大鼠的心臟，打開心包后在左心耳的下緣用6/0 帶線眼科針縫扎左冠狀動(dòng)脈前降支，可見室壁搏動(dòng)減弱蒼白，心電圖ST 段或T 波抬高表示成功。然后，縫合大鼠胸廓肌肉、皮下組織和皮膚，關(guān)閉大鼠胸腔，隨后3 d，每12 h 肌肉注射400 000 U 青霉素。待大鼠的自主呼吸恢復(fù)后撤掉呼吸機(jī)。假手術(shù)組的8 只大鼠只進(jìn)行開胸、左冠狀動(dòng)脈前降支血管下穿線，但不予血管結(jié)扎，其他的手術(shù)步驟相同。

1.2 方法

1.2.1 超聲心動(dòng)圖檢查術(shù)后4 周各組大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，檢測(cè)各組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）。

1.2.2 大鼠心肌組織取材及標(biāo)本制備建模4 周后，各組大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射，麻醉、處死，快速開胸取出心臟，冰鹽水沖洗后，沿結(jié)扎處垂直于心臟長(zhǎng)軸方向?qū)⒆笮氖乙环譃槎糠中募≠A存于液氮中待用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的檢測(cè)，其余部分心肌組織于70%乙醇過(guò)夜，隨后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切成厚度4 μm 的切片，再經(jīng)過(guò)60 ℃烤片后室溫放置過(guò)夜，待自然干燥后行蘇木精-伊紅（HE）染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察切片病理變化。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA 表達(dá)水平使用Trizol 法提取梗死區(qū)周圍心肌細(xì)胞總RNA，將1 μg 的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，RT-PCR 檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物TNF-α、IL-6 及M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 水平。見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件對(duì)本研究所涉及數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多重比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況比較假手術(shù)組大鼠因麻醉過(guò)深死亡1只，存活率為87.5%；36只AMI模型組大鼠，術(shù)后24 h 內(nèi)存活19 只，存活率為55.9%，明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠1 周內(nèi)各死亡2 只，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余大鼠存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 超聲心動(dòng)圖結(jié)果術(shù)后4 周，3 組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、FS 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），與假手術(shù)組比較，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠LVESD、LVEDD 均升高，LVEF、FS 均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVESD、LVEDD 均降低，LVEF、FS 均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 術(shù)后4 周各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of echocardiographic indexes of rats in each group 4 weeks after operation ±s

表2 術(shù)后4 周各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of echocardiographic indexes of rats in each group 4 weeks after operation ±s

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05。t1，對(duì)照組與假手術(shù)組比較；t2，實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組比較；t3，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

組別假手術(shù)組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t1值t2值t3值F值例數(shù)7 8 7 LVESD（mm）3.75±0.35 7.12±0.58*6.04±0.47*#-13.316-10.326 3.894 93.033 LVEDD（mm）7.48±0.49 9.97±0.86*8.55±0.63*#-6.708-3.558 3.584 24.631 LVEF（%）69.27±6.23 32.60±3.56*39.97±4.71*#14.239 9.924-3.448 114.299 FS（%）50.45±3.22 24.07±3.03*29.77±3.51*#16.340 11.486-3.374 132.926

2.3 左心室組織形態(tài)學(xué)改變術(shù)后4 周HE 染色顯示：假手術(shù)組的心肌細(xì)胞纖長(zhǎng)，大小均勻，排列有序，無(wú)明顯炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；對(duì)照組的心肌細(xì)胞腫大明顯，排列雜亂無(wú)章，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂，可見明顯炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞稍有腫大，排列稍雜亂，心肌纖維偶有斷裂，稍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

圖1 心肌組織HE 染色結(jié)果（HE，×200）Fig.1 HE staining results of myocardial tissue（HE，×200）

2.4 術(shù)后4周梗死區(qū)周圍組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-6、TNF-α和M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、

TGF-β1的mRNA表達(dá)水平術(shù)后4周，3組大鼠梗死區(qū)周圍組織IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠IL-6、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-10、TGFβ1 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of relative expression of IL-6，TNF-α，IL-10 and TGF-β1 mRNA in each group ±s

表3 各組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of relative expression of IL-6，TNF-α，IL-10 and TGF-β1 mRNA in each group ±s

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05。t1，對(duì)照組與假手術(shù)組比較；t2，實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組比較；t3，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

組別假手術(shù)組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t1值t2值t3值F 值例數(shù)7 8 7 IL-6 mRNA 0.50±0.13 1.65±0.13*0.99±0.10*#-16.966-7.555 10.837 164.551 TNF-α mRNA 0.57±0.13 2.37±0.20*1.00±0.11*#-20.037-6.545 15.984 274.265 IL-10 mRNA 0.42±0.16 1.05±0.13*1.80±0.12*#-8.291-18.329-11.481 175.571 TGF-β1 mRNA 0.44±0.11 0.93±0.17*1.43±0.15*#-6.430-13.978-5.899 77.546

3 討論

近年來(lái)，AMI 的發(fā)病率居高不下［9］，心梗后心衰也就成了心血管系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，也是致死的主要原因。眾所周知，AMI 后的心室重構(gòu)是其重要病理基礎(chǔ)。AMI 出現(xiàn)后，即有大量的中性粒細(xì)胞滲入到梗死部位，隨后出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，在AMI 后的炎癥反應(yīng)及損傷壞死組織的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用［10］，并影響患者的心室重構(gòu)及心功能。過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織損傷，延緩組織修復(fù)，在梗死心肌組織修復(fù)過(guò)程中單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥顯得尤為重要［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地塞米松干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而抑炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1 的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠的心肌組織形態(tài)學(xué)改變及心功能也顯著優(yōu)于對(duì)照組，提示糖皮質(zhì)激素可調(diào)節(jié)心肌梗死后心肌組織的炎癥因子的表達(dá)，小劑量地塞米松可減輕心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，改善心肌梗死后心功能。

巨噬細(xì)胞在機(jī)體的宿主防御、炎癥反應(yīng)等調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要作用，是先天免疫的重要組成部分，巨噬細(xì)胞極化不是固定的，因?yàn)榫奘杉?xì)胞具有足夠的可塑性，可以整合多種信號(hào)，例如來(lái)自微生物、受損組織和正常組織環(huán)境的信號(hào)［1-3，12-13］。在激活過(guò)程中巨噬細(xì)胞主要有促炎的M1 型和抗炎的M2 型巨噬細(xì)胞兩種亞型，M1 型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)表達(dá)TNF-α及IL-6 等細(xì)胞因子，M2 型巨噬細(xì)胞具有高表達(dá)IL-10 的表型特征，可以誘導(dǎo)表達(dá)TGF-β等細(xì)胞因子［1，12，14-15］。研究［16-17］表明，單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥是心肌缺血再灌注損傷和AMI后愈合過(guò)程的主要機(jī)制。MASAKI等［18］研究發(fā)現(xiàn)，用過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激動(dòng)劑靶向干預(yù)動(dòng)物模型中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，使其偏移于抗炎的M2 型，可抑制急性炎癥并促進(jìn)AMI 后心臟愈合，降低了AMI 后的病死率。

目前，在人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素是M2 型巨噬細(xì)胞極化的重要刺激物［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)：術(shù)后4 周，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死區(qū)周圍組織的M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-6、TNF-α和M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，但在實(shí)驗(yàn)組大鼠的M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-6、TNF-α明顯低于對(duì)照組，而M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示心肌梗死后存在明顯巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，而糖皮質(zhì)激素的干預(yù)可能促進(jìn)心肌梗死區(qū)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，從而減輕心肌梗死后的炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，保護(hù)心功能。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型極化來(lái)抑制心肌組織炎癥反應(yīng)及梗死后心室重構(gòu)，特別是對(duì)于具有糖皮質(zhì)激素適應(yīng)征的其他基礎(chǔ)疾病的AMI 患者，本研究提供了一定的臨床意義，但其具體加用糖皮質(zhì)激素的時(shí)間、劑量以及糖皮質(zhì)激素的多效性和巨噬細(xì)胞的多面性在AMI 的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后中還存在眾多未知領(lǐng)域，還需要進(jìn)一步的研究。