彭 洪，彭明沙△，馮雪雅， 龔 磊

1.南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院 肛腸外科 (南充 637000)；2.南充市中心醫(yī)院 胃腸外科(南充 637000)

結(jié)直腸癌是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家最主要的惡性腫瘤之一[1-2]。早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率約為90%，但是晚期和已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅在15%[3-4]。因此，鑒別與結(jié)直腸癌診斷、分期和預(yù)后相關(guān)的生物分子，探尋結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

MicroRNAs(miRNAs,19～25 nt)是一大類非編碼RNA,在哺乳動(dòng)物中可通過與靶基因3′-非編碼區(qū)特異性結(jié)合發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用。miRNA參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，miR-127-5p在多個(gè)惡性腫瘤中的表達(dá)水平低，然而miR-127-5p在結(jié)直腸癌中的作用及其下游機(jī)制尚不清楚。因此，本研究檢測了miR-127-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供了潛在的作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW480、HCT116、SW620、HT29)及FHC人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 miR-127-5p mimic購自廣州萊博公司。NEK1、KRAS抗體及相應(yīng)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自江蘇晶美科技有限公司，CCK-8檢測試劑盒購自上海碧云天公司，NEK1過表達(dá)載體由廣州萊博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測miR-127-5p的表達(dá) 提取經(jīng)病理科證實(shí)的50例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及配對(duì)的癌旁正常組織，使用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用PCR法檢測miR-127-5p mRNA的表達(dá)。使用Trizol試劑提取SW480、HCT116、SW620、HT29、LoVo及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用PCR法檢測miR-127-5p mRNA的表達(dá)。miR-127-5p引物：Sequence(5′-3′)： 5′-GCCAGUCGCUUAAUAA-3′。miR-127-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct法進(jìn)行分析?！鰿t=(Ct miR-127-5p -CtU6)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=(△Ct miR-127-5p -△CtU6)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；相對(duì)樣品初始模板量=(2-△△Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2 miR-127-5p對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將1×105個(gè)/mL HT29細(xì)胞接種于24孔板，在100 μL培養(yǎng)基中加入2 μL miR-127-5p mimic，混勻，在100 μL培養(yǎng)基中加入加入2 μL Lipofectamine 3000，混勻，然后將稀釋好的miR-127-5p mimic和Lipofectamine 3000混合并混勻，將復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，設(shè)置空白對(duì)照組(Blank)及陰性對(duì)照組(NC),使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。

1.2.3 miR-127-5p靶基因的篩選和驗(yàn)證 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRBase對(duì)miR-127-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，選擇NEK1作為目標(biāo)靶基因，并用雙熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 NEK1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 構(gòu)建NEK1過表達(dá)載體pcDNA3.0-NEK1質(zhì)粒，在96孔板內(nèi)每孔接種密度為1×105個(gè)/mL HT29細(xì)胞懸液，在25 μL的DMEM培養(yǎng)基中加入0.4 μg pcDNA3.0- NEK1質(zhì)粒并混勻，Lipofe ctamine 3000混合，混勻后加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，設(shè)置空白對(duì)照組(Blank)及空載質(zhì)粒組(pcDNA3.0)，用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，方法如前述。

1.2.5 與NEK1相互作用蛋白的確定 從http://thebiogrid.org蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫中查找可與NEK1相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)KRAS可與NEK1相互作用。

1.2.6 NEK1對(duì)KRAS表達(dá)的影響 通過pcDNA3.0-NEK1質(zhì)粒上調(diào)NEK1的表達(dá)，設(shè)置陰性對(duì)照組，收集兩組結(jié)直腸癌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液30 min后再離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑10 cm),取上清液測蛋白濃度后用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)蛋白的表達(dá)。

1.2.7 miR-127-5p對(duì)KRAS表達(dá)的影響 通過miR-127-5p mimic上調(diào)miR-127-5p的表達(dá)，設(shè)置陰性對(duì)照組，Western blot檢測兩組HT29細(xì)胞中KRAS蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-127-5p在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

通過PCR方法檢測miR-127-5p mRNA在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，miR-127-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)(圖1)。

2.2 miR-127-5p在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

通過PCR法檢測miR-127-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116、SW620、HT29、LoVo及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-127-5p在FHC細(xì)胞株中表達(dá)量高，在LoVo細(xì)胞株中表達(dá)量低，選擇中等表達(dá)的HT29細(xì)胞株用于后續(xù)研究(圖2)。

2.3 過表達(dá)miR-127-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

為觀察miR-127-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-127-5p mimic，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于Blank及NC組，miR-127-5p mimic組中HT29細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)(表1、圖3)。

表1 miR-127-5p過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

注：與Blank組相比較，#P<0.05

2.4 NEK1是miR-127-5p的靶基因

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRBase分析篩選出miR-127-5p的靶基因,miR-127-5p可與NEK1直接結(jié)合(圖4)。

為了證實(shí)上述推測，構(gòu)建NEK1野生型及突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒并進(jìn)行熒光素酶活性測定，結(jié)果表明miR-127-5p明顯抑制了含有野生型NEK1報(bào)告基因的熒光素酶活性(P<0.05)而不是突變型NEK1(P>0.05),這些數(shù)據(jù)證實(shí)NEK1是miR-127-5p直接作用的靶點(diǎn)(圖5)。

2.5 過表達(dá)NEK1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

為觀察NEK1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NEK1質(zhì)粒上調(diào)NEK1的表達(dá)， CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Blank及pcDNA3.0組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NEK1后HT29細(xì)胞增殖能力明顯增高(P<0.05)(表2、圖6)。

表2 NEK1過表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

注：與Blank組比較，#P<0.05

2.6 與NEK1相互作用蛋白的確定

從http://thebiogrid.org蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫中查找可與NEK1相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)KRAS可與NEK1相互作用(圖7)。

2.7 過表達(dá)NEK1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中KRAS蛋白表達(dá)

在結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-NEK1質(zhì)粒上調(diào)NEK1的表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)NEK1可上調(diào)KRAS蛋白表達(dá)水平(P<0.05)(圖8)。

2.8 過表達(dá)miR-127-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中KRAS蛋白表達(dá)

在結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-127-5p mimic上調(diào)miR-127-5p的表達(dá),與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-127-5p可抑制KRAS蛋白表達(dá)水平(P<0.05)(圖9)。

3 討論

miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。既往研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，miR-127在多種惡性腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌和肝癌)中表達(dá)下調(diào)，且miR-127-5p的表達(dá)水平與肝癌的組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。研究[8]證明在肝癌細(xì)胞中miR-127-5p是通過DNA甲基化進(jìn)行調(diào)控的，DNA甲基化抑制劑50-aza-20脫氧胞苷可劑量依賴性誘導(dǎo)miR-127-5p的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-127-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，并且miR-127-5p在人正常結(jié)直腸黏膜FHC細(xì)胞中的表達(dá)水平高于結(jié)直腸癌細(xì)胞株，提示miR-127-5p與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-127-5p可以抑制HT29細(xì)胞的增殖能力，證實(shí)miR-127-5p在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色。

miRNA主要是通過抑制靶基因的表達(dá)在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-127-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)NEK1可能是miR-127-5p的靶基因。進(jìn)一步通過雙熒光素酶法證實(shí)NEK1可與miR-127-5p靶向結(jié)合。NEK1是人類NIMA(never in mitosis gene a,NIMA)蛋白激酶家族中一個(gè)成員，最初被認(rèn)定為細(xì)胞有絲分裂所必需的蛋白激酶。NIMA相關(guān)激酶除了參與有絲分裂，還具有多種細(xì)胞功能[9]。人類NIMA蛋白激酶家族包含11個(gè)NIMA相關(guān)激酶，其中NEK1和NEK4主要參與DNA損傷反應(yīng)及DNA修復(fù)的信號(hào)通路[10-12]，抑制NEK1的表達(dá)可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定[13]。小鼠NEK1基因的缺失可導(dǎo)致多囊腎病及面部畸形、侏儒、男性不育、貧血和囊性脈絡(luò)叢，這些表型的多效性顯示NEK1在早期發(fā)育中具有重要作用[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)在發(fā)育的后期NEK1基因突變會(huì)使人具有肌萎縮側(cè)索硬化易感性，表明NEK1在控制疾病進(jìn)展和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。除此之外，NEK1在腦膠質(zhì)瘤和腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，還可通過使電壓依賴性陰離子通道蛋白1持續(xù)磷酸化抑制腎癌細(xì)胞凋亡，而下調(diào)Nek1的表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和增加化療敏感性[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)在HT29細(xì)胞中過表達(dá)Nek1可促進(jìn)HT29細(xì)胞增殖，這些研究結(jié)果表明Nek1是一種致癌基因。

為進(jìn)一步研究NEK1促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖的作用機(jī)制，本研究通過蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫查找可與NEK1相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)KRAS蛋白可與NEK1相互作用。KRAS蛋白(最初在Kirsten大鼠肉瘤病毒中鑒定)是RAS/MAPK信號(hào)通路的一部分，其功能是通過GTPase將活性GTP轉(zhuǎn)化為非活性GDP發(fā)揮開關(guān)作用，其在控制生長、成熟和細(xì)胞死亡的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中至關(guān)重要。KRAS蛋白是一種原癌基因，其由作用于轉(zhuǎn)錄延伸階段的miRNA分子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)與基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)所調(diào)控。研究[18-19]表明約30%的結(jié)直腸癌存在KRAS突變，其可預(yù)測腫瘤的分級(jí)及對(duì)化療的反應(yīng)。這些突變可改變KRAS的GTP酶活性，并可能激活增殖信號(hào)通路[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NEK1可上調(diào)KRAS蛋白的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)。相反，過表達(dá)miR-127-5p則可下調(diào)KRAS蛋白的表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果表明miR-127-5p可靶向抑制NEK1的表達(dá)，NEK1的下調(diào)則導(dǎo)致KRAS蛋白表達(dá)降低，使MAPK/ERK信號(hào)通路失活從而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，miR-127-5p作為抑癌基因在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其可通過調(diào)控NEK1/KRAS通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，有望在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮重要作用。然而miR-127-5p對(duì)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的抑制作用及與下游靶基因和信號(hào)通路的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。