李 萍，王 靜，戴成祥，朱 華

1.上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù) (上海 201210)；2.上海賽比曼生物科技有限公司 (上海 201210)；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心 (上海 200127)

當(dāng)前，移植手術(shù)需要的器官來(lái)源主要依靠公民死亡后的捐贈(zèng)，移植分為兩種，即尸體和活體器官，尸體器官占我國(guó)目前可進(jìn)行器官移植手術(shù)的絕大部分[1-2]。腎臟移植是臨床各科室中成功率較高的器官移植，但移植排斥是導(dǎo)致移植失敗的主要難題[3-4]。當(dāng)移植腎由高炎癥狀態(tài)的腦死亡者提供時(shí)，進(jìn)行臨床腎移植后易導(dǎo)致臨床免疫排斥反應(yīng)加重，恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，從而使移植腎不能持久存活或功能不全[5]。

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSC)能夠緩和壞死組織、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，成為腎移植過(guò)程中的主要參與者。國(guó)際ISCT指導(dǎo)方針表明，MCS由具有貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞群體組成，有超過(guò)95%細(xì)胞都可表達(dá)CDl55及CD73等，MCS多存在骨髓和脂肪組織內(nèi)。MSC在移植器官中發(fā)揮重要作用，有效改善器官移植時(shí)出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)，挽救邊緣捐贈(zèng)器官，并可減少機(jī)體自身免疫應(yīng)激導(dǎo)致的組織纖維化過(guò)程。有研究[7]對(duì)大鼠進(jìn)行移植腎時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用MSC對(duì)腎臟進(jìn)行輸注，90 d后腎小管和腎小球功能恢復(fù)正常，腎纖維化解除，說(shuō)明MSC在腎移植過(guò)程中具有改善作用。腫瘤壞死因子(TNF-a)具有炎性的細(xì)胞因子[8]，有研究[9]表明，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí)，TNF-a表達(dá)升高，IL-1β是最早被人們發(fā)現(xiàn)的白介素炎癥因子，在眾多疾病中都發(fā)揮作用，但在腎移植中的研究還比較少見(jiàn)，因此，本研究于移植前靜脈輸注MSC處理腦死亡供鼠，旨在探討其對(duì)移植腎炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 雄性、雌性大鼠各半，體重(0.2±0.012)kg，移植腎的供者為無(wú)特殊病原體(specificpathogen free，SPF)級(jí)F344大鼠，移植腎的受者為SPF級(jí)Lewis大鼠，均購(gòu)自美國(guó)Charles River,此次研究符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(上海，Qiyi Biotechnology)，IL-1β(上海,Research Biotechnology)，TNF-α(北京， Luyuan Bird Biotechnology)，二氨基聯(lián)苯胺試劑盒(上海，Crystal anti-effective company)，新山地明(德國(guó)，Scherer GmbH)，自動(dòng)生化分析儀(日本日立)，Masson'sTrichrome試劑盒(上海韻涵)，一抗、LIJ羊抗小鼠二抗、LIJ羊抗兔二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所),actin抗體、PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，免疫熒光試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋生物商城)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)施方法

1.2.1 收集骨髓MSC 麻醉F344大鼠后，將股骨和脛骨放在L-DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，反復(fù)沖洗，收集沖洗液，以離心半徑60 mm，轉(zhuǎn)速4 000 r/min, 離心15 min，棄上清液，加胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)，收集骨髓MSC，加入胰酶后30 min采用磷酸鹽緩沖洗3次。加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人抗體，37.5 ℃孵育30 min， 保存到-80 ℃中備用。

1.2.2 分組處理 分為活體供腎移植組、腦死亡供腎移植組、MSC輸注組(腦死亡供腎移植)3組，每組各5例F344大鼠和5例Lewis大鼠。1)活體供腎移植組： F344大鼠仰臥固定，85%乙醇消毒，腹部切口，游離腎臟，同時(shí)剪斷輸尿管。再在左側(cè)腎動(dòng)脈處開(kāi)口，供腎置人4 ℃生理鹽水，肝素灌注左腎動(dòng)脈，將供腎原位植入已切除左腎的Lewis大鼠體內(nèi)。兩定點(diǎn)法端端吻合腎動(dòng)靜脈和輸尿管。開(kāi)放血流后，移植腎情況良好。2)腦死亡供腎移植組：給予F344大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉，在動(dòng)脈處安置血壓監(jiān)測(cè)管，氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)。將3F Fogarty管垂直插人大鼠顱內(nèi)，增大導(dǎo)管氣囊，大鼠腦死亡后，6 h后取左側(cè)腎臟，移植到Lewis大鼠體內(nèi)。3)MSC輸注組：F344大鼠腦死亡后，靜脈輸注異體F344大鼠的MSC 5×106個(gè)，6 h后摘除左側(cè)腎臟，移植到Lewis大鼠。

1.2.3 生命體征及腎血流動(dòng)力檢測(cè) 建模后，觀察3組大鼠AMP及HR變化，并采用多普勒血流顯像儀檢測(cè)大鼠PSV、EDV、及MN等水平。

1.2.4 組織提取 手術(shù)當(dāng)天起，給予所有受者新山地明(0.15 mg/100 g，1次/d,肌注，10 d，切除其右腎。術(shù)后35 d獲取移植腎標(biāo)本，作病理學(xué)檢測(cè)。

1.2.5 3組大鼠血清中的生化指標(biāo) 建模成功及注射MSC 14 d后，取大鼠靜脈血2 mL，自動(dòng)生化分析儀監(jiān)測(cè)，觀察3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血清肌酐水平。

1.2.6 Masson′s Trichrome 檢測(cè)3組大鼠腎組織病理分析，提取3組大鼠腎組織切片,用8%甲醛在低溫下進(jìn)行48 h處理,用無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水,DMB透明處理,石蠟包埋2 μm，24 h后清水洗凈，并自然風(fēng)干，采用Masson′sTrichrome試劑盒染色，步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織變化。

1.2.7 TUNEL 檢測(cè) 取3組大鼠腎組織冰凍切片，2 μm的5張，4%多聚甲醛溶液固定，滴加阻斷劑后室溫孵育2 min，后進(jìn)行TUNEL染色，棕色為凋亡的上皮細(xì)胞，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反復(fù)PBS洗片，甘油PBS溶液封片后，每只大鼠切片分別隨機(jī)觀察30個(gè)不同視野計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，采用Lasersharp 2000軟件進(jìn)行攝像，計(jì)算出平均值。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TNF-α蛋白表達(dá) 在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液,并注入2 mL的培養(yǎng)基停止消化,再將細(xì)胞提取液放入EP管中,并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進(jìn)行混合,再放入冰箱中冷凍10 min使細(xì)胞完全裂變,成為E溶液;在EP管中放入腎組織并按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 mL,使細(xì)胞完全裂變,成為F溶液;再把E和F溶液以80∶1的體積進(jìn)行搖勻,配制成工作液,放入37.5 ℃的保溫箱中20 min,冷卻后計(jì)算TNF-α蛋白濃度。

1.2.9 免疫熒光檢測(cè)IL-1β 免疫熒光石蠟切片脫蠟水化，水去除非特異性干擾(30%雙氧水)，采用5%多聚甲醛固定，20 min后，進(jìn)行PBS沖洗，再用Triton 處理10 min，采用3%BSA密封1 h，培育24 h， 將羊抗小IgG Alexa Flour488加入，在避光下培育1 h，用PBS洗滌3次，加入4,6-diacetyl-2-phenyl decanoate，在37.5 ℃下避光染色15 min，放置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腎臟移植后的生命體征及腎血流動(dòng)力變化

3組大鼠移植后生命體征(AMP、HR)在加壓前、中后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腎血流動(dòng)力學(xué)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1～2)。

表1 3組大鼠腎臟移植后的生命體征比較

表2 3組大鼠腎血流動(dòng)力的變化

注：與活體供腎移植組比較，*P<0.05；與腦死亡供腎移植組比較，#P<0.05

2.2 術(shù)后血清肌酐值比較

術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，與腦死亡供腎移植組相比，活體供腎移植組和MSC輸注組的血清肌酐均較低(P<0.001)，術(shù)后第21天，MSC輸注組的血清肌酐值高于活體供腎移植組((P<0.05)(表3)。

2.3 觀察3組大鼠腎組織病變程度

活體供腎移植組腎組織排列整齊，腦死亡腎移植組上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，MSC輸注組仍然可見(jiàn)輕度腎小球肥大，但與腦死亡腎移植組比較，腎小球體積變小，腎小管水腫減輕，有少量中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)(圖1)。

表3 術(shù)后血清肌酐值比較

注：F值、P值為3組組建整體比較；t1、P1為腦死亡供腎移植組與活體供腎移植組比較；t2、P2為MSC輸注組與活體供腎移植組比較，t3、P3為MSC輸注組與腦死亡供腎移植組比較

2.4 3組大鼠腎上皮細(xì)胞凋亡情況比較

棕色表示凋亡的上皮細(xì)胞，活體供腎移植組平均凋亡率為19.5%，腦死亡供腎移植組腎上皮細(xì)胞平均凋亡率最高(43.0%)，與腦死亡供腎移植組相比，MSC輸注組上皮細(xì)胞有所好轉(zhuǎn)，凋亡率為29.4%(圖2～3)。

注：與活體供腎移植組比較，*P<0.05；與腦死亡供腎移植組比較，#P<0.05

2.5 3組大鼠免疫熒光檢測(cè)IL-1β

腦死亡供腎移植組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)明顯高于活體供腎移植組，MSC輸注組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)稍多于腦死亡供腎移植組(圖4)。

2.6 3組大鼠腎組織中TNF-α蛋白表達(dá)

腦死亡供腎移植組大鼠腎組織中TNF-α蛋白表達(dá)(14.89±2.17)明顯最高于活體供腎移植組(5.13±1.62)，TNF-α蛋白在MSC輸注組的表達(dá)少于腦死亡供腎移植組(7.42±1.08)(圖5～6)。

注：與活體供腎移植組比較，*P<0.05；與腦死亡供腎移植組比較，#P<0.05

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于MSC治療慢性腎病的研究逐漸增多，龔正媛[9]研究發(fā)現(xiàn)，采用MSC對(duì)腎病大鼠具有改善腎毛細(xì)血管及減輕腎小球纖維化的作用。王萍[10]研究表明，在大鼠腎臟纖維化過(guò)程中，MSC能減少纖維化病變程度，減少周圍毛細(xì)血管的丟失，但對(duì)大鼠的存活率無(wú)意義。MSC能夠減少炎癥浸潤(rùn)[11]，這與本文病理研究結(jié)果一致，說(shuō)明MSC在改善大鼠腎病的同時(shí)，能夠局部改善腎纖維化的過(guò)程，緩解腎組織纖維化。

當(dāng)移植腎由高炎癥狀態(tài)的腦死亡者提供時(shí)，產(chǎn)生和釋放大量炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重臨床排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植腎臟后器官恢復(fù)減慢，功能衰退。若移植前可減輕腦死亡供腎的“炎癥”程度，改善供腎情況，可使其功能和長(zhǎng)期存活能力加強(qiáng)。MSC具有高度自我更新和代謝及免疫調(diào)節(jié)能力，可促進(jìn)細(xì)胞因子大量分泌，直接與免疫細(xì)胞接觸發(fā)揮作用。本研究分為活體供腎移植組、腦死亡供腎移植組、MSC輸注組3組，于移植前靜脈輸注MSC處理腦死亡供鼠，旨在探討其對(duì)移植腎炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清肌酐水平在腦死亡供腎移植組表達(dá)最高，在MSC輸注組高于活體供腎移植組。機(jī)體內(nèi)血清肌酐水平越高對(duì)機(jī)體的傷害越大，會(huì)減弱腎小球的過(guò)濾功能，加重組織纖維化，導(dǎo)致腎功能下降。MSC輸注組腎功能的損害程度較弱。腦死亡供腎移植組中性粒細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)嚴(yán)重，MSC輸注組可見(jiàn)輕度炎性浸潤(rùn)，相比腦死亡供腎移植組上皮細(xì)胞腫脹減輕，在活體供腎移植組腎組織無(wú)異常表現(xiàn)[12]。MSC可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，抵抗巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和分化，改善受損的腎組織，降低移植腎炎癥水平，改善移植腎質(zhì)量和功能，增強(qiáng)其長(zhǎng)期存活能力[13]。楊軍等[14]通過(guò)大鼠缺血再灌注實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腎動(dòng)脈中輸注MSC可減少中性粒細(xì)胞表達(dá)，說(shuō)明MSC可在腎組織中快速遷移并做功，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，有利于腎組織的好轉(zhuǎn)。

腦死亡供腎移植組凋亡程度最高，MSC輸注組凋亡程度減弱，活體供腎移植組最輕。MSC可抑制大鼠腎纖維化轉(zhuǎn)化，減少上皮細(xì)胞凋亡，這可能與抑制TNF-α和IL-1β有關(guān)[15]。TNF-α和IL-1β是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的代表因子之一，通過(guò)多種有害細(xì)胞活化表達(dá)，如NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。陳緯緯等[16]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制腦死亡腎移植TNF-α和IL-1β的活性表達(dá)，馬華林等[17]將MSC用于腎移植24 h后發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯減少，能夠降低炎性因子的釋放，改善病情。段淑芳等[18]發(fā)現(xiàn)，MSC在腎移植過(guò)程中可發(fā)揮明顯抗炎作用，阻礙巨噬細(xì)胞活化，從而抑制NF-α和IL-1β釋放，減少腎移植過(guò)程中受到的損傷[19-20]，與本研究結(jié)果一致。上述結(jié)果提示，可能是MSC的免疫原性較低，因此能夠改善移植腎質(zhì)量和功能，增強(qiáng)長(zhǎng)期存活能力。

綜上所述，移植前輸注MSC能夠減少腦死亡大鼠腎炎性浸潤(rùn)狀態(tài)，抑制腎上皮細(xì)胞凋亡，高含量的MSC能夠減少TNF-α和IL-1β表達(dá)，減少腎排除現(xiàn)象發(fā)生。