高小潔, 茍秋鳳, 蘇森森, 姚 芳, 許曉羽, 謝擁軍, 潘 渠

成都醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室(成都 610500)

乳桿菌是存在于人體腸道中的重要益生菌，它們?cè)诰S持人體腸道環(huán)境的微生態(tài)平衡和提高機(jī)體免疫力方面有著關(guān)鍵作用[1]。如植物乳桿菌06CC2可改善小鼠急性結(jié)腸炎[2]。羅伊乳桿菌可抵擋病原體感染[3]。約翰遜乳桿菌能減輕呼吸道病毒感染[4]。鼠李糖乳桿菌可減輕行為缺陷[5]。乳桿菌的腸外益生作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腦-腸-微生物軸來(lái)調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和迷走神經(jīng)通路[6]。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了乳桿菌不僅在維持腸道微生物平衡中扮演重要角色，而且有助于宿主的心理健康。

焦慮行為通常是一種與壓力有關(guān)的情緒障礙[7]。先前研究[8-10]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了乳桿菌可以緩解宿主的焦慮，如植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌。Kelly等[11]報(bào)道，鼠李糖乳桿菌不能改善健康男性的壓力或認(rèn)知表現(xiàn)。再者，Steenbergen等[12]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、唾液乳桿菌可減輕宿主的好斗傾向，但對(duì)減輕焦慮意義不大。以上兩位的研究都沒(méi)有檢測(cè)菌株在腸道中的黏附定植情況，然而益生菌在腸道內(nèi)的黏附定植可能是其產(chǎn)生心理效應(yīng)的必備條件。

糞便乳桿菌(Lactobacillusfaecis)是2013年從南非豺狼和浣熊糞便中分離得到乳桿菌新種[13]。本研究中糞便乳桿菌FZB1(CGMCC 10515)是2010年從四川富順縣白鷺新鮮糞便中分離提取的，且已經(jīng)進(jìn)行了16 S rDNA、RNA聚合酶α亞基(rpoA)和重組酶A基因(recA)的測(cè)序和生化特性測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 菌株

福菜乳桿菌YM0097從臺(tái)灣生物資源收集與研究中心購(gòu)買(mǎi)，糞便乳桿菌FZB1、植物乳桿菌PC518、E.coliE57儲(chǔ)存于成都醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。糞便乳桿菌FZB1、福菜乳桿菌YM0097、植物乳桿菌PC518在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置過(guò)夜，E.coliE57在LB培養(yǎng)基中37 ℃震蕩過(guò)夜。所有菌體通過(guò)離心收集(8 000 r/min，離心半徑6.5 cm，4 ℃，10 min)，然后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)重新懸浮并調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL(OD600nm=0.5)。

1.2 糞便跟蹤

rpoA、recA具有保守性，其DNA序列具有物種特異性。本研究中對(duì)糞便乳桿菌FZB1的兩個(gè)基因進(jìn)行了測(cè)序，并將其序列上傳GenBank，登錄號(hào)為KP325479、KP325478。采用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)引物rpoA-F-5′-TGGTGTGATCGAACCGTTTG-3′，rpoA-R-5′-AGGGTCGAGGCTATGTTTCC-3′；recA-F-5′-TGGGACATCAAACGTGCTTG-3′，recA-R-5′-ATCGATGCGTTGCTCTTGTC-3′。

PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為194、188 bp。使用序列比對(duì)工具BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果。結(jié)果表明，兩對(duì)引物均能特異性擴(kuò)增糞便乳桿菌FZB1的recA和rpoA基因。為檢測(cè)引物，以植物乳桿菌PC518、糞便乳桿菌FZB1和Balb/cJ小鼠糞便樣品(有或無(wú)糞便乳桿菌FZB1)為模板，進(jìn)行PCR。用本研究設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)Balb/cJ小鼠糞便17 d。為制備PCR模板，糞便樣品在100 ℃下加熱3 min，11 200 r/min，離心半徑6.5 cm，離心5 min，取上清液作為模板。PCR為20 μL體系，由2 μL的模板，3 μL引物，5 μL超純水，10 μL的2×Taq Master Mix(Dye Plus)組成。PCR程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，40 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，45 s；共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃末端延伸5 min。每天隨機(jī)抽取兩份PCR樣本送出測(cè)序，BLAST比對(duì)序列。

1.3 行為測(cè)試

1.3.1 動(dòng)物 有研究[14]報(bào)道，焦慮行為可以通過(guò)RU24969(5-HT受體激動(dòng)劑)誘導(dǎo)，而用5-HT受體抑制劑氟西汀可減輕焦慮。根據(jù)成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)行以下實(shí)驗(yàn)方案。Balb/cJ雄性小鼠(n=110，體重20～25 g，8～10 周齡)每籠22只，分飼喂或不飼喂糞便乳桿菌FZB1兩組飼養(yǎng)。按Kantak等[14]方法分5組：1)生理鹽水組；2)RU24969組；3)FZB1+RU24969組；4)氟西汀+RU24969組；5)FZB1+氟西汀+RU24969組。糞便乳桿菌FZB1和氟西汀灌胃劑量分別為1×107CFU/d和10 mg·kg-1·d-1，飼養(yǎng)4周。

1.3.2 焦慮行為誘導(dǎo) 采用10 mg/kg劑量的RU24969誘導(dǎo)焦慮行為。行為測(cè)試在腹腔注射60 min后進(jìn)行。

1.3.3 Morris圓形水迷宮(morris water maze, MWM) 焦慮會(huì)影響學(xué)習(xí)和記憶的表現(xiàn)，可用MWM來(lái)評(píng)估學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)Jung等[15]進(jìn)行了修改，水池深28 cm，加入100 mL墨水(24±2) ℃。第1天在沒(méi)有設(shè)置平臺(tái)的情況下進(jìn)行90 s游泳訓(xùn)練。接下來(lái)4 d，小鼠每天接受4次平臺(tái)就位實(shí)驗(yàn)。如果小鼠沒(méi)有在90 s內(nèi)游到平臺(tái)，則將其在平臺(tái)上停留10 s。最后將平臺(tái)沒(méi)于水下1 cm，水面上不可見(jiàn)，然后記錄小鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間。

1.3.4 高架十字迷宮(elevated plus maze, EPM) EPM通常用于測(cè)試焦慮行為。用Mark等[16]描述的EPM實(shí)驗(yàn)方法和步驟。EPM由一個(gè)“+”字交叉型支架組成，兩臂封閉，兩臂開(kāi)放。臂長(zhǎng)28.5 cm，離地面55.0 cm。將小鼠面向封閉臂放在EPM的中心。實(shí)時(shí)記錄小鼠在開(kāi)放和封閉的臂中停留時(shí)間。進(jìn)入臂定義為小鼠80%的身體進(jìn)入了臂。每次實(shí)驗(yàn)前用75%乙醇消毒EPM。以下數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算獲得：1)進(jìn)臂總數(shù)；2)進(jìn)入開(kāi)放臂的小鼠百分比(100%×進(jìn)入開(kāi)放臂的小鼠/進(jìn)臂總數(shù))；3)小鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比(100%×小鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間/進(jìn)臂總時(shí)間)。

1.3.5 社交行為實(shí)驗(yàn) (social interaction test, SIT) SIT是參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。將1對(duì)飼喂相同食物的小鼠放入1個(gè)盒子里(50 cm×30 cm×30 cm)，安靜環(huán)境，40 W紅燈下，放置10 min。為了減少新環(huán)境不適，小鼠在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前2 d被放置在測(cè)試盒子熟悉環(huán)境，2 次/d，5 min/次。電腦記錄小鼠間接觸次數(shù)和接觸時(shí)間，包括跟隨同伴、追趕同伴、嗅生殖器、打架、趴在小鼠身上以及頭與頭接觸。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

行為測(cè)試數(shù)據(jù)用自動(dòng)追蹤的攝像機(jī)記錄。采用SPSS 13.0軟件作統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析判斷組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特殊說(shuō)明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞便追蹤

用糞便乳桿菌FZB1和飼養(yǎng)糞便乳桿菌FZB1的Balb/cJ小鼠糞便為模板，用rpoA或recA引物對(duì)進(jìn)行PCR，然后做凝膠電泳，分別擴(kuò)增194 bp和188 bp條帶，共進(jìn)行了17 d實(shí)驗(yàn)，從第14天開(kāi)始就不能擴(kuò)增出194 bp和188 bp兩個(gè)條帶。用未飼養(yǎng)糞便乳桿菌FZB1的Balb/cJ小鼠糞便和植物乳桿菌PC518模板進(jìn)行PCR，不能獲得條帶。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，PCR獲得的194 bp和188 bp片段分別代表糞便乳桿菌FZB1的rpoA和recA基因。這表明糞便乳桿菌FZB1在Babl/cJ小鼠腸道內(nèi)黏附并定植了13 d。

2.2 MWM

注射RU24969后，與生理鹽水組相比，小鼠在MWM中到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間延長(zhǎng)，這表明成功建立了Balb/cJ小鼠的焦慮模型。與生理鹽水+RU24969組相比，飼養(yǎng)糞便乳桿菌FZB1的小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；此外，F(xiàn)ZB1+RU24969組改善程度低于氟西汀+RU24969組(P<0.05)；而FZB1+氟西汀+RU24969組的改善程度高于單獨(dú)使用糞便乳桿菌FZB1或氟西汀組(P<0.05)(圖1)。

2.3 EPM

EPM用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物的探索行為。注入RU24969組的3個(gè)探索指標(biāo)(進(jìn)臂總數(shù)、進(jìn)入開(kāi)放臂的小鼠百分比和小鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比)低于生理鹽水組。飼養(yǎng)糞便乳桿菌FZB1的小鼠與生理鹽水+RU24969組相比，3個(gè)指標(biāo)分別提高了166.6%、71.6%和66.9%(圖 2)。

2.4 SIT

以小鼠互動(dòng)的次數(shù)和時(shí)間作為社交技能的指標(biāo)。注射RU24969后，兩項(xiàng)指標(biāo)均低于生理鹽水組，而喂食糞便乳桿菌FZB1后，兩項(xiàng)指標(biāo)均較RU24969組明顯提高，分別提高了77.9%和111.1%(圖 3)。

圖3 SIT

注：A：互動(dòng)時(shí)間；B：互動(dòng)次數(shù)；各組間比較，P<0.05

3 討論

益生菌的益生作用取決于它們?cè)谖改c道中的黏附和定植。本研究中通過(guò)PCR檢測(cè)糞便樣本，研究糞便乳桿菌FZB1在小鼠腸道中的黏附定植情況。Matsumoto等[18]報(bào)道雙歧桿菌亞種LKM512在老年人腸道中定植7周，改善了老年人腸道微環(huán)境。在另一項(xiàng)研究中，Balzaretti等[19]報(bào)道了副干酪乳桿菌LPC-S01和DG菌株在健康志愿者腸道定植7 d。Selim等[20]報(bào)道，使用雞糞便進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR直到第27天檢測(cè)到耐熱乳桿菌，盡管含量相對(duì)低。Saito[21]對(duì)12名志愿者糞便進(jìn)行了5 d的檢測(cè)，只在1名志愿者糞便中檢測(cè)到瑞士乳桿菌GCL1001。此外，Kelly等[11]報(bào)道，鼠李糖乳桿菌JB-1的心理益生作用對(duì)小鼠明顯而對(duì)人不明顯，這可能是因?yàn)樵摼昴軌蛟谛∈竽c道中定植，而不能在人類腸道中定植有關(guān)。益生菌發(fā)揮益生作用可能需要腸道定植，且可能與定植時(shí)間呈正相關(guān)。因此，菌株在宿主中的定植時(shí)間對(duì)于證明益生菌的有效性是重要的?？赏ㄟ^(guò)PCR追蹤益生菌在宿主腸道的定植情況。

不管記憶障礙是由氨芐青霉素還是東莨菪堿誘導(dǎo)的，發(fā)酵乳桿菌NS9[22]、植物乳桿菌C29、戊糖乳桿菌[15]和雙歧桿菌、沙克乳桿菌I033[23]的二次發(fā)酵提取物已被證明在MWM中改善記憶障礙是有效的。EPM中，發(fā)酵乳桿菌NS9[22]、短雙岐桿菌1205、植物乳桿菌PS128和瑞士乳桿菌NS8均能有效改善焦慮行為。使用SIT的研究結(jié)果表明，瑞士乳桿菌R0052、長(zhǎng)雙歧桿菌R0175[24]和鼠李糖乳桿菌JB-1[5]可改善抑郁或焦慮行為。在本研究中，MWM、EPM和SIT結(jié)果均顯示，糞便乳桿菌FZB1可減輕小鼠焦慮行為，氟西汀和糞便乳桿菌FZB1對(duì)改善焦慮有協(xié)同作用。如果這些效果在人類臨床試驗(yàn)中能得到證實(shí)，那么就有可能為患有焦慮癥的人開(kāi)發(fā)一種含有糞便乳桿菌FZB1制劑的聯(lián)合藥物。