木亞林，岳 愷，李 明

南陽市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科 (南陽 473000)

食管癌(esophageal carcinoma， EC)是世界上最常見和致命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率排名第八，死亡率高居第六，每年有30 萬人死于食道癌[1]。雖然診斷和治療技術(shù)均有所改善，但由于預(yù)后不良和復(fù)發(fā)，食管癌仍然很難痊愈，5年生存率約為10%[2]。因此，迫切需要探索食管癌的分子機制和食管癌早期診斷的生物標志物，為改善EC患者的長期生存提供新的治療策略。已有研究表明miR-381 能夠抑制宮頸癌[3]、甲狀腺乳頭狀癌[4]、口腔鱗癌[5]等多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲，但是其對食管癌的作用尚不清楚，有待進一步研究。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷酸肌醇3激酶相關(guān)激酶家族的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過激活核糖體激酶來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、存活和侵襲轉(zhuǎn)移[6]。p70s6激酶(the p70s6 kinase，p70s6k)是mTOR/p70s6k信號通路下游mTOR的主要效應(yīng)器[7]。mTOR/p70s6k信號通路調(diào)控許多腫瘤的存活和細胞增殖，在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤中普遍被激活[8]。特異性蛋白1(specificity protein 1，SP1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移中發(fā)揮重要作用。已有研究[9]表明SP1在食管癌中高表達，且與預(yù)后不良有關(guān)。本文主要探討miR-381-3p靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信號通路對食管癌細胞的增殖和凋亡調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)購自上海善然生物科技有限公司；胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司；miR-381-3p mimic 質(zhì)粒、miR-control質(zhì)粒、SP1質(zhì)粒及各引物均由上?；蛑扑幱邢薰驹O(shè)計并合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海恪敏生物科技有限公司；QIAzol裂解試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司； SYBR-Green PCR試劑盒購自上海賽默飛世爾科技公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司； RIPA裂解緩沖液購自南京?？藸柹锟萍加邢薰荆?BCA試劑盒購自上海易色醫(yī)療科技有限公司； MTT試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(WL02809)購自上海萬類生物科技有限公司； Ki67抗體(AF1738)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid protease 3，Caspase-3)抗體(AC031-2)、B淋巴細胞瘤2(b-celllymphoma，Bcl-2)抗體(AB112-1)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所； Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ml120073)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體(ab2732)、p-mTOR抗體(ab8440)購自上海艾博抗生物科技有限公司；p70s6激酶(the p70s6 kinase，p70s6k)抗體(SPC-1039D-A565)購自廈門研科生物技術(shù)有限公司；p-p70s6k抗體(AP0540)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，雷帕霉素購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及標本來源 正常食管細胞(HEEC)和食管癌細胞(EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790)購自美國模式培養(yǎng)物研究所，將細胞于含10% 胎牛血清、100 U/ mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)。收集患者術(shù)后新鮮食管癌組織及其癌旁正常組織( 距癌組織邊緣≥2 cm) 作為檢測樣本，置于-80 ℃的冰箱中保存待檢。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期細胞，接種于6孔板每孔(1×106個/mL)。當達到80% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將100 nmol/L 的miR-381-3p mimic 質(zhì)粒、miR-control質(zhì)粒、SP1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進入EC9706細胞。

1.2.2 RT-qPCR 采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行。U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔc t方法計算。miR-381-3p 的上游引物序列為：5′-CCAGUGCA CCGACCCUUGAG ACUGC-3′， miR-381-3p的下游引物序列為：5′-AGCCUAAACUCGGUCCAA GCAUC-3′； U6的上游引物序列：5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′， U6的下游引物序列：5′-AACGC TTCACGAATTT GCGT-3′； SP1 的上游引物序列： 5′-TGGTGGGC AGTATGTTGT-3′，SP1 的下游引物序列： 5′-GC TATTGGCATTGGTGAA-3′。

1.2.3 靶基因預(yù)測 運用基因預(yù)測軟件：TargetScan (http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-381-3p的靶基因。

1.2.4 雙熒光素酶報告檢測靶向關(guān)系 〗收集對數(shù)期的EC9706細胞鋪于96孔板，每孔約4×103個細胞，24 h后，分別轉(zhuǎn)染miR-control+SP1 WT、miR-control+SP1 MUT 、miR-381-3p mimic+SP1 WT、miR-381-3p mimic +SP1 MUT，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒說明進行測定，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

1.2.5 MTT法檢測細胞活性 根據(jù)MTT試劑盒說明進行操作：取對數(shù)期EC9706 細胞100 μL加入96孔板(1×104個/孔)，轉(zhuǎn)染后在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入10 μL溶液A，再培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)基，加入溶液B，于搖床上低速振蕩10 min，在570 nm波長處測定吸光值。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24 h后離心， 按1×106個/mL的細胞濃度重懸。細胞懸液中加入5 μL異硫氰酸熒光素標記的磷脂結(jié)合蛋白V和5 μL碘化丙啶，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot) 收集各組EC9706細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，然后經(jīng) 12% SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000、Caspase-3 1∶1 000、mTOR 1∶1 000、p-mTOR 1∶2 000、p70s6k 1∶1 000、p-p70s6k 1∶1 000、SP1 1∶500)在4 ℃封閉過夜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-381-3p、SP1在食管癌組織和正常組織中的表達差異

通過qRT-PCR檢測正常食管組織和食管癌組織中miR-381-3p和SP1 mRNA的表達，與正常食管組織相比，食管癌組織中miR-381-3p mRNA的表達明顯下調(diào)，而SP1 mRNA的表達的表達明顯上調(diào)(P<0.01)。

通過qRT-PCR檢測正常食管細胞HEEC和食管癌細胞EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790中miR-381-3p和SP1 mRNA的表達，與正常食管細胞HEEC相比，食管癌細胞EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790中miR-381-3p mRNA的表達明顯下調(diào)，而SP1 mRNA的表達的表達明顯上調(diào)(P<0.01)。后續(xù)實驗選擇EC9706細胞株進行(圖1)。

2.2 miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測， miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點。為了進一步驗證 miR-381-直接作用于SP1，進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒?。miR-381高表達明顯抑制了含有野生型SP1質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對突變型SP1質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響(P<0.01)。進一步為了驗證miR-381高表達對SP1的作用，Western blot檢測各組細胞SP1 蛋白的表達。與control組細胞相比，miR-control組細胞中SP1 蛋白表達無明顯變化，miR-381 mimic組細胞中SP1 蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)，SP1組細胞中SP1 蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細胞中SP1 蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)。因此，miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達(圖2)。

注：A：TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點；B：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-381-3p與SP1靶向關(guān)系；C：Western blot檢測各組細胞SP1 蛋白的表達，與control組相比，**P<0.01；與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01

2.3 miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細胞凋亡

MTT法檢測細胞增殖情況可知，與Control組細胞相比，miR-control組細胞增殖無明顯變化，miR-318 mimic組細胞增殖明顯降低(P<0.01)，SP1組細胞增殖明顯增高(P<0.01)；與miR-318 mimic組相比，miR-318 mimic+SP1組細胞增殖明顯增高(P<0.01)。因此，miR-318 靶向SP1抑制食管癌細胞EC9706增殖。

為了進一步證實miR-381-3p對食管癌細胞增殖的作用，運用Western blot檢測各組細胞增殖標記Ki67、PCNA的蛋白表達。與control組細胞相比，miR-control組細胞中Ki67、PCNA 蛋白表達無明顯變化；miR-381 mimic組細胞中Ki67和PCNA蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)；SP1組細胞中Ki67、PCNA 蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細胞中Ki67、PCNA蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)。證實了miR-318 靶向SP1抑制食管癌細胞EC9706增殖。

流式檢測各組細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與Control組細胞相比，miR-control組細胞凋亡率無明顯變化，miR-318 mimic組細胞凋亡率明顯降升高(P<0.01)，SP1組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；與miR-318 mimic組相比，miR-318 mimic+SP1組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。因此，miR-318 靶向SP1誘導(dǎo)食管癌細胞EC9706凋亡。

為了進一步證實miR-381-3p對食管癌細胞凋亡的作用，運用Western blot檢測各組細胞凋亡標記蛋白Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3的表達。與control組細胞相比，miR-control組細胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達無明顯變化，miR-381 mimic組細胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)，SP1組細胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)。本實驗證實了miR-318 靶向SP1誘導(dǎo)食管癌細胞EC9706凋亡(圖3)。

注：A：MTT法檢測各組細胞增殖情況，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01;B、C：Western blot檢測各組細胞增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達水平，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01；D、E：流式檢測各組細胞凋亡情況，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01；F、G：Western blot檢測各組細胞凋亡標記蛋白Bax/Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-sp mimic組相比，##p<0.01

2.4 miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細胞中mTOR/p70s6k信號通路激活

mTOR/p70s6k信號通路和癌癥的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，假設(shè)miR-381-3p靶向SP1能夠調(diào)控食管癌細胞中mTOR/p70s6k信號通路。通過Western blot檢測p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，與control組細胞相比，miR-control組細胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達無明顯變化，miR-381 mimic組細胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)，SP1組細胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)，說明miR-318 靶向SP1抑制食管癌細胞EC9706中mTOR/p70s6k信號通路激活(圖4)。

2.5 抑制mTOR/p70S6K信號通路抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡

為了研究mTOR/p70S6K信號通路對食管癌細胞EC9706增殖和凋亡的作用，用100 nmol/L的雷帕霉素處理24 h，然后使用MTT、流式細胞術(shù)、Western blot評估細胞增殖、凋亡情況。與對照組相比，雷帕霉素處理組組細胞增殖明顯降低(P<0.01)，細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，增殖標記蛋白Ki67表達明顯下調(diào)(P<0.01)，凋亡標記蛋白cleaved caspase-3表達明顯上調(diào)(P<0.01)，而SP1蛋白表達無明顯變化，說明雷帕霉素抑制mTOR/p70S6K信號通路，能夠抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡，但不會影響SP1蛋白的表達。所有數(shù)據(jù)提示mTOR/p70s6k信號通路可能參與miR-381-3p調(diào)控食管癌細胞的增殖和凋亡(圖5)。

注： A：MTT法檢測各組細胞增殖情況,與control組相比，**P<0.01；B：流式檢測各組細胞凋亡情況，**P<0.01；C：Western blot檢測各組細胞Ki67、Cleaved caspase-3和SP1的表達，與control組相比，**P<0.01

3 討論

miRNA是一類小的非編碼，單鏈具有約18-25個核苷酸的RNA，通常通過與靶mRNA的3′-UTR的互補結(jié)構(gòu)域結(jié)合來調(diào)節(jié)靶信使RNA表達的轉(zhuǎn)錄后水平。其與多種生物功能和病理學(xué)過程密切相關(guān)，包括細胞增殖、分化、細胞凋亡和自我更新等，在腫瘤發(fā)生中充當啟動子或抑制因子[10]。miR-381在腫瘤細胞中低表達，過表達miR-381能夠抑制腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲中。例如，miR-381在乳腺癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-381可通過靶向CXCR4抑制乳腺癌細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[11]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p在食管癌細胞EC9706中低表達，過表達miR-381-3p能夠抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡。這些結(jié)果有力地表明了miR-381-3p在食管癌中的潛在腫瘤抑制作用。

SP1在腫瘤存活、進展和轉(zhuǎn)移所需的腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如，SP1在乳腺癌中過度表達，可以調(diào)節(jié)TINCR-MIR-7-KLF4軸，從而刺激細胞增殖并抑制細胞凋亡[12]。本課題組發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞中SP1表達上調(diào)。已有研究[13]發(fā)現(xiàn)SP1是各種細胞行為包括細胞周期，增殖和凋亡的中介，且在癌癥中SP1受多個miRNA調(diào)節(jié)，如，在骨肉瘤中，據(jù)報道m(xù)iR-493通過靶向SP1抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，因此可以開發(fā)miR-493/SP1軸作為潛在的治療靶點。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞中，miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達，從而調(diào)控食管癌細胞增殖和凋亡。

本項研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-381-3p后，食管癌細胞增殖明顯降低、Ki67和PCNA蛋白表達明顯下調(diào)，細胞凋亡率明顯降升高、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)；而高表達SP1可以逆轉(zhuǎn)miR-381-3p對食管癌細胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。Ki67是細胞增殖相關(guān)蛋白，其表達水平越高表明處于增殖周期的細胞越多[14]。PCNA是增殖細胞核抗原，與細胞DNA合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標[15]。Bcl-2是抗細胞凋亡蛋白， Bax是促細胞凋亡蛋白，Bax/Bcl-2比值決定細胞受到凋亡刺激信號時發(fā)生凋亡還是生存[16]。cleaved Caspase-3是凋亡程序中的主要執(zhí)行者之一，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的標志性蛋白[17]。因此，miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細胞凋亡。

mTOR是進化的保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為調(diào)節(jié)因子參與多種細胞活動包括細胞增殖，代謝，生長和存活等過程，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、存活和侵襲轉(zhuǎn)移[18]。p70S6K是mTOR的下游靶標之一，其以雷帕霉素敏感的方式調(diào)節(jié)翻譯起始復(fù)合物，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制下的主要翻譯調(diào)節(jié)因子[19]。mTOR可以促進p70S6K磷酸化，從而刺激翻譯細胞從周期G1到S階段所需的蛋白質(zhì)，促進細胞生長[20]。已有研究[21]表明在食管癌中mTOR/p70S6K信號通路被異?；罨?。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細胞中mTOR/p70s6k信號通路激活，用雷帕霉素抑制mTOR/p70S6K信號通路，能夠抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡，提示miR-381-3p靶向SP1通過抑制mTOR/p70S6K信號通路來抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡。

綜上所述，在食管癌細胞中，miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達；miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細胞凋亡，抑制mTOR/p70s6k信號通路激活；同時，抑制mTOR/p70S6K信號通路能夠抑制EC9706細胞增殖、促進細胞凋亡；提示miR-381-3p靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信號通路，從而抑制食管癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。這為食管癌的診斷和治療提供參考數(shù)據(jù)，其動物體內(nèi)實驗還有待進一步研究。