石 嬌，吳東明，李 靜，許 穎

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科(成都610500)

痛風性關節(jié)炎是由于體內尿酸代謝異常引起的高尿酸癥，過多的尿酸鈉(monosodium urate, MSU)晶體沉積于關節(jié)腔、滑膜、軟骨等關節(jié)組織而導致炎性病變[1]。隨著人們生活質量的提高，生活方式和飲食習慣發(fā)生變化，痛風性關節(jié)炎的發(fā)病率和患病率在全球范圍內快速增長且有年輕化趨勢，目前我國痛風性關節(jié)炎的患病率約為1%～3%[2-3]。

近幾年研究[4]發(fā)現，細胞焦亡在心血管、內分泌、感染性等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中均有參與。細胞焦亡是一種有別于細胞凋亡和細胞壞死的炎癥性程序性死亡模式，細胞焦亡過程中核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerizatiin domain, NOD)樣受體(NOD-like receptor, NLR)炎性小體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)等蛋白質和復合物發(fā)揮著重要作用[5]。目前，細胞焦亡是否參與痛風性關節(jié)炎的發(fā)病機制尚無研究，因此本研究擬通過檢測急性痛風性關節(jié)炎患者血清中白細胞介素1β(Interleuin-1beta, IL-1β)和PBMCs(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中IL-1β及caspase-1的表達水平，探討細胞焦亡與痛風性關節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展的關系，為疾病的診斷、治療及防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年8月至2019年3月于成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院門診就診的急性痛風性關節(jié)炎患者40例，正常對照組選取體檢中心實驗指標正常的健康體檢人群40例。納入標準：所有急性痛風性關節(jié)炎患者均符合1977年美國風濕協會(American college of rheumatology, ACR)急性痛風性關節(jié)炎的分類標準；發(fā)病后未服用糖皮質激素、秋水仙堿等藥物。排除標準：合并心腦血管疾病、腎臟系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、感染性及自身免疫相關疾病。40例急性痛風性關節(jié)炎患者(acute gout, AG)和健康對照者(healthy controls, HC)分別為AG組、HC組。

1.2 材料

IL-1β酶聯免疫吸附試劑盒購自上海生物工程有限公司；樣本密度分離液購自天津灝洋華科生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自江蘇長星醫(yī)療科技有限公司；MD-AIM-V細胞培養(yǎng)基購自美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司；IL-1β抗體、caspase-1購自Abcom公司；生化試劑購自邁克生物有限公司；其余試劑、耗材購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 標本采集及處理

分別采集AG組和HC組肝素抗凝全血5 mL，用樣本密度分離液分離全血中的PBMCs，將分離得到的PBMCs中加入MD-AIM-V細胞培養(yǎng)基300 μL吹打混勻后備用。采用全自動血球分析儀(希森美康XS-500i)進行 PBMCs的純度驗證。采用免疫印跡法檢測PBMCs中IL-1β、caspase-1的蛋白水平：對收集備用的PBMCs于4 ℃下以12 000 r/min離 心10 min后，通過調整蛋白濃度至6 mg/L后進行蛋白表達檢測，記錄并進行灰度值分析，將目的蛋白與內參蛋白(β-actin)灰度值比較，作為目的蛋白的相對表達量。

同時分別采集AG組和HC組靜脈血4 mL，3 500 r/min離心5 min后，分離血清備用。采用全自動生化分析儀(日立式7600型)檢測血清中尿酸(uric acid, UA)、肌酐(creatinine, CREA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、谷氨酸氨基轉移酶(alaninetransaminase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase, AST)、總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、前白蛋白(prealbumin, PA)的含量。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-1β表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PBMCs的驗證結果

PBMCs是外周血單個核細胞，其包括淋巴細胞(lymphocyte, LYMP)和單核細胞(monocyte, MONO)。AG組和HC組全血分離的細胞主要為PBMCs，純度達(94.91±2.40)%(表1、圖1)。

表1 AG組與HC組 PBMCs驗證結果

2.2 兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結果

兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結果提示，AG組較HC組IL-1β和caspase-1表達水平增強(圖2)。

2.3 兩組UA、CREA、BUN、PA、ALT、AST、TP、ALB的檢測結果

AG組與HC組年齡、TP和ALB差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，AST、ALT差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，UA、CREA、BUN、PA差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表2)。

表2 AG組與HC 組一般臨床資料

2.4 AG組與HC組血清中IL-1β檢測結果

GA組的IL-1β的表達比HC組明顯升高，GA組IL-1β表達量為(1.08±0.79) μg/L，HC組IL-1β表達量為(0.30±0.08)μg/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.036,P<0.001)(圖3)。

2.5 AG組UA、BUN、CREA與IL-1β相關性比較

血清UA與IL-1β呈正相關性(r=0.501,P=0.004)，血清BUN、CREA與IL-1β無相關性(圖4)。

3 討論

近年來，由于痛風性關節(jié)炎對組織器官的嚴重損害以及多樣化的并發(fā)癥使其成為困擾人類健康的一大難題。目前痛風性關節(jié)炎的診斷主要依靠臨床表現和影像學檢查[3]。實驗室檢測指標主要有血清中尿酸含量檢測和關節(jié)炎發(fā)作時關節(jié)液微生物培養(yǎng)情況，但關節(jié)液的采集比較困難且微生物培養(yǎng)周期用時長，不利于作為常規(guī)檢查開展，因此需尋找更多有效的實驗室檢測指標用于急性痛風性關節(jié)炎的早期診斷及鑒別診斷，以及為監(jiān)測患者治療期間的變化提供有效的幫助。在本研究中，除UA在AG組較HC組升高，還可見BUN、CREA、PA、ALT、AST等指標呈增加趨勢，這是因為在痛風性關節(jié)炎發(fā)展過程中，體內尿酸的生成增多，而腎臟排泄減少，加重體內腎臟和肝臟代謝負擔，從而出現肝功能和腎功能的指標異常變化。血清中BUN、CREA、PA、ALT、AST的含量變化可用作評估急性痛風性關節(jié)炎的伴隨癥狀。

痛風性關節(jié)炎的病理生理不僅與高尿酸血癥有關，還涉及炎癥小體的激活。炎癥反應是參與介導急性痛風性關節(jié)炎的一個重要過程，本研究中可見，血清中IL-1β在AG組的表達較HC組有明顯升高，Ma等[5-6]也證實痛風性關節(jié)炎炎癥反應與炎性因子IL-1β的表達增加有關。IL-1β屬于IL-1的分泌型，是血液循環(huán)中主要存在的形式，也是MSU晶體誘導炎癥反應的關鍵因子，IL-1β參與急性痛風性關節(jié)炎炎癥的發(fā)生發(fā)展，可作為痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作指標。本研究進一步發(fā)現PBMCs中IL-1β和caspase-1蛋白水平的表達，AG組IL-1β和caspase-1蛋白水平明顯高于HC組。caspase-1蛋白水平的表達增加與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLR family, Pyrin domain containing 3, NLRP3)炎癥小體介導的細胞焦亡信號通路有關[7-9]。細胞焦亡經典激活途徑主要表現為caspase-1的活化，NLRP3炎癥小體激活，導致炎性因子的釋放,從而誘發(fā)級聯放大的炎性反應，對機體的免疫應答和免疫反應具有重要的調節(jié)作用[10-11]。急性痛風性關節(jié)炎發(fā)病過程是由于關節(jié)腔內尿酸鹽濃度急劇增加，導致MSU晶體的不斷形成，MSU晶體作為內源性損傷相關因子激活NLRP3炎癥小體組裝，活化的NLRP3炎性小體剪切caspase-1前體形成成熟的caspase-1，caspase-1繼而切割IL-1β前體，促進IL-1β的成熟及分泌，最終導致痛風性關節(jié)炎的炎性反應[12]。房樹標等[12]研究采用IL-1β的抑制劑后發(fā)現，caspase-1表達減少，NLRP3炎性小體的信號通路降低，進一步證實了IL-1β的產生與caspase-1介導的NLRP3信號通路有關。

綜上所述，IL-1β和caspase-1介導的細胞焦亡在痛風性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。但caspase-1介導的細胞焦亡過程中除有IL-1β釋放，還有白細胞介素18(Interleuin-18, IL-18)等炎性因子釋放，后續(xù)的研究中將繼續(xù)檢測更多的焦亡指標，進一步驗證細胞焦亡在痛風性關節(jié)炎中的作用。