張永紅，張 杰，張 橋，榮 林，孫永全，呂文旭，柏瑞彤

齊魯醫(yī)藥學(xué)院 (淄博 255300)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是臨床上常見的肝臟疾病，主要是由于長時(shí)間大量飲酒所引發(fā)的肝臟損害性病變[1]。為治療ALD，近年來人們做了很多研究，如發(fā)現(xiàn)CYP2E1的表達(dá)水平[2]、細(xì)胞因子[3-4]等，都與ALD的發(fā)生關(guān)系密切，但在有效治療ALD方面，僅局限在戒酒、營養(yǎng)支持、對癥藥物治療及肝移植等[5-7]，因此如何才能安全且有效的預(yù)防和治療酒精性肝損傷便具有重要意義[8]。

近年來，人們對真菌多糖的研究不斷深入，越來越多真菌多糖的活性被開發(fā)和研究利用[9-13]。玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)又叫玉蜀黍黑粉菌，屬于擔(dān)子菌亞門，冬孢菌綱，黑粉菌目，黑粉菌科，孢堆黑粉菌屬，分布范圍廣。大量研究[14]證實(shí)，玉米黑粉菌具有諸多生物活性，比如在《植物病原真菌學(xué)》一書中，就記載了玉米黑粉菌的藥用價(jià)值。費(fèi)尚芬等[15]也提出玉米黑粉菌可藥用，利肝臟。陳利軍等[16]指出玉米黑粉菌具有利膽保肝、益腸胃，解毒作用，可用于預(yù)防和治療肝臟系統(tǒng)疾病和胃腸道潰瘍，并能助消化、通便。但目前關(guān)于玉米黑粉菌多糖的研究極少，本研究建立了小鼠急性酒精肝損傷模型，研究了玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用，為玉米黑粉菌多糖的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠60只，雄性，20～24 g，購自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 藥品及主要試劑 玉米黑粉菌子實(shí)體干品，來自齊魯醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳研究中心；聯(lián)苯雙酯，購自淄博仁濟(jì)堂醫(yī)藥連鎖有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)檢測試劑盒，購自南京建成生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號(hào)RE-3000A，購自上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)，型號(hào)V-5000，購自上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米黑粉菌粗多糖的提取 玉米黑粉菌60 ℃烘干，粉碎，過40目篩，取黑粉菌粉末1∶20料液比，于70 ℃水浴中3 h，提取3次，4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清，合并3次提取液。70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入4倍體積95%乙醇，4 ℃沉淀過夜。4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取沉淀，于60 ℃烘干，得玉米黑粉菌粗多糖。

1.2.2 脫蛋白 將粗多糖溶解于100 mL水中，沙維積法(Sevag法)(多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=20∶4∶1)脫蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，加入4倍體積95%乙醇，4 ℃沉淀過夜，4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取沉淀，于60 ℃烘干，得玉米黑粉菌精多糖。

1.2.3 多糖含量測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法測定[17]。精確吸取稀釋10倍多糖溶液2 mL，加入6%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL充分混勻，顯色，在490 nm波長處測其吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和多糖的吸光度值計(jì)算多糖含量。

1.2.4 小鼠AST、ALT、AKP含量測定 昆明系小鼠60只隨機(jī)分為空白組、模型組[生理鹽水(150 mg/kg)]、陽性組[聯(lián)苯雙酯(150 mg/kg)]、高糖組(400 mg/kg)、中糖組(200 mg/kg)、低糖組(100 mg/kg)，每組各10只。每天灌胃給藥1次，持續(xù)30 d，最后1次給藥1 h后，除空白組給予生理鹽水外，其余5組均按12 mL/kg的量灌胃給予50%酒精[18]。禁食24 h后，眼球采血，4 000 r/min，離心半徑6 cm，離心10 min，取血清，測定ALT、AST、AKP含量。

1.2.5 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查 取各小組小鼠肝臟，經(jīng)10%甲醛溶液固定，然后70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精依次脫水，石蠟包埋、切成6 μm薄蠟片，并用蘇木素-伊紅(HE)染色，制作病理切片，在40倍光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(圖1)。

2.2 玉米黑粉菌多糖的含量

玉米黑粉菌細(xì)粉，經(jīng)過水提醇沉，得到玉米黑粉菌粗多糖，得率為13.01%。粗多糖通過Sevag法脫蛋白后，又經(jīng)乙醇沉淀過夜、干燥后得精多糖，其得率為1.52%。玉米黑粉菌的多糖含量為92.37%，多糖含量較高，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 玉米黑粉菌多糖對小鼠血清AST、ALT、AKP影響

與空白組相比，模型組血清中AST、ALT、AKP含量明顯升高(P<0.05)，說明小鼠急性酒精肝損傷模型已建立。與模型組相比，陽性組和高糖組血清中AST、ALT、AKP含量明顯降低(P<0.05)，說明一定濃度的玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷具有保護(hù)作用(表1)。

組別 ALT/(U/L)AST/(U/L)AKP/(U/100 mL)空白組18.95±2.53?21.39±6.78??13.82±1.46?模型組27.75±6.7739.43±9.4819.81±1.99陽性組14.43±5.68??27.90±3.12?14.17±4.17?高糖組18.03±3.24?25.60±6.54??14.67±6.50?中糖組20.29±7.8033.04±5.2012.91±3.49?低糖組24.47±6.7036.21±7.4313.54±1.86?

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.4 玉米黑粉菌多糖對小鼠病理切片的影響

根據(jù)病理切片結(jié)果可知，空白組：肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈輻射狀排列，可見數(shù)個(gè)肝單、雙核細(xì)胞，未見明顯細(xì)胞變性及壞死。模型組：肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肝細(xì)胞核固縮明顯，細(xì)胞內(nèi)有明顯脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，肝細(xì)胞索排列紊亂。陽性組：肝細(xì)胞治療效果較明顯，個(gè)別肝細(xì)胞可見脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，可見數(shù)個(gè)肝單、雙核細(xì)胞，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肝細(xì)胞索呈輻射狀排列，無明顯細(xì)胞變性及壞死。低劑量組：肝細(xì)胞無明顯修復(fù)，治療效果不明顯，肝細(xì)胞核固縮明顯，細(xì)胞內(nèi)有明顯脂肪空泡和氣球樣變，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肝細(xì)胞索排列紊亂。中劑量組：肝細(xì)胞得到一定修復(fù)，但治療效果不太明顯，可見壞死肝細(xì)胞，肝細(xì)胞核固縮明顯，可見細(xì)胞內(nèi)有明顯脂肪空泡(脂滴)，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肝細(xì)胞索呈輻射狀排列。高劑量組：肝細(xì)胞治療效果明顯，細(xì)胞內(nèi)無明顯脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，可見數(shù)個(gè)肝雙核細(xì)胞，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肝細(xì)胞索呈輻射狀排列，無明顯細(xì)胞變性及壞死，提示玉米黑粉菌多糖可減輕肝損傷(圖2)。

3 討論

急性酒精肝損傷的動(dòng)物模型，肝細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞質(zhì)中ALT、AST流出，因此血清ALT、AST升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[19]；AKP也是反映肝功能的酶，在各種肝病診斷中有較高應(yīng)用價(jià)值[20]。本研究中，因聯(lián)苯雙酯保肝降酶效果明顯，具有穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、增強(qiáng)對肝細(xì)胞損傷的修復(fù)、改善肝組織病理損害的功能[21]，所以選擇聯(lián)苯雙酯為陽性對照觀察保肝作用，保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。陽性對照組和高糖組小鼠血清中ALT、AST、AKP含量明顯比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但中糖組、低糖組含量與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明玉米黑粉菌多糖發(fā)揮護(hù)肝作用可能需達(dá)到一定濃度(400 mg/kg)才可，濃度太低(200 mg/kg或100 mg/kg)沒有護(hù)肝作用。病理切片的結(jié)果和各指標(biāo)的測定結(jié)果相符，提示玉米黑粉菌多糖可有效保護(hù)肝細(xì)胞，降低酒精對肝細(xì)胞的損傷。

自然界存在著種類繁多的天然活性多糖，有細(xì)菌多糖、植物多糖、藻類多糖、動(dòng)物多糖和真菌多糖等[22]。真菌多糖是從天然真菌里面提取的一類由醛基和酮基通過糖苷鍵連接起來而形成的高分子聚合物。由于真菌多糖在真菌菌絲體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁含量較多，其他部分含量相對較少，故提取真菌多糖主要從真菌菌絲體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁中提取。真菌多糖的提取方法有水提醇沉法、超聲波輔助法、酶提取法、微波提取法等[23]，本研究采用最傳統(tǒng)的水提醇沉法提取玉米黑粉菌多糖，雖操作簡單，但時(shí)間長，得率不高，還須進(jìn)一步研究提取方法，增加得率。

玉米黑粉菌多糖是一類重要的生理活性物質(zhì)，也是玉米黑粉菌功效成分之一[24]，但關(guān)于玉米黑粉菌多糖的活性研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)率先研究了玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用，為研究其抗腫瘤、抗氧化、抑菌等活性提供基礎(chǔ)，為玉米黑粉菌多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。