姜 玲，湯玉蓉，熊文婕，俞 汀，鄭永娉，沈小雪，林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南京 210029

慢性便秘（chronic constipation，CC）是全球范圍內(nèi)常見的胃腸功能障礙性疾病，嚴(yán)重影響人們身心健康和生活質(zhì)量，成為多種心腦血管病變致殘致死的誘因［1］。最新數(shù)據(jù)顯示，我國8.2%的人群受便秘困擾（約1億人）［2］，男女比例約為1∶2.3［3］，育齡期和妊娠期婦女發(fā)病率更高［4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，致便秘發(fā)生［5-6］。然而，雌激素抑制結(jié)腸平滑?。╯mooth muscle cell，SMC）收縮的機(jī)制尚未完全明確。

肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化水平是決定平滑肌收縮程度的關(guān)鍵因素。MLC 磷酸化水平受鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和鈣離子非依賴的肌球蛋白磷酸酶（MLCP）的雙重調(diào)節(jié)［7］。RhoA/ROCK 通路是調(diào)控MLCP 活性的主要通路之一（鈣敏化機(jī)制）［8-10］?；罨蟮腞OCK 主要通過2 條途徑抑制MLCP 活性：其一是通過磷酸化MLCP 的調(diào)節(jié)亞單位MYPT1，使其失去催化MLC脫磷酸化的能力，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)磷酸化MLC 水平提升，使平滑肌收縮；其二是通過磷酸化一種平滑肌特異性磷蛋白CPI?17，使其發(fā)生一系列構(gòu)象改變而抑制MLCP 活性［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制冠脈、膀胱、尿道、血管等平滑肌RhoA/ROCK 表達(dá)［13-15］。因此，本研究旨在從細(xì)胞水平探討17β?雌二醇（17β?estraiol，，E2）對(duì)大鼠結(jié)腸平滑肌上RhoA/ROCK通路的影響，為治療雌激素相關(guān)性便秘等胃腸動(dòng)力障礙提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級(jí)雌性Sprague?Dawley（SD）大鼠，10 日齡［南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（蘇）2016?000］。DMEM 培養(yǎng)液、青霉素?慶大霉素雙抗（Hyclone 公司，美國），胎牛血清、Ⅱ型膠原酶（Gibco公司，美國），E2、牛血清白蛋白（BSA）結(jié)合的E2（BSA?E2）、雌激素受體阻斷劑ICI182780、雌激素受體α（ERα）選擇性激動(dòng)劑PPT、雌激素受體β（ERβ）選擇性激動(dòng)劑DPN（Sigma 公司，美國），ROCK 抑制劑Y27632（Selleck 公司，美國），RhoA、ROCK1、α?肌動(dòng)蛋白（α?SMA）抗體（Abcam 公司，美國），p?MYPT1、p?CPI17、p?MLC、β?actin抗體（CST公司，美國），ERα、ERβ抗體（Santa Cruz 公司，美國），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、DAPI、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天公司），Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗、FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗（Bioworld公司，美國），Super ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo 公司，美國），試劑盒（TaKaRa公司，日本）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國），酶標(biāo)儀（Mo?lecular Devices 公司，美國），蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio?Rad 公司，美國），凝膠成像分析系統(tǒng)（GE Healthcare公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠結(jié)腸SMC的分離及培養(yǎng)

將出生12～15 d SD 雌性大鼠斷頸處死，自肛門上2 cm取結(jié)腸5～7 cm左右，以PBS緩沖液快速反復(fù)沖洗，去除黏膜層和漿膜層，剪碎平滑肌組織，加入10%Ⅱ型膠原酶消化液，吹打消化5 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清反復(fù)重懸離心3 次，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化并重懸細(xì)胞、過篩，接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞隔天換液。

待SMC長至致密單層時(shí)，以PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，加入同體積含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化。收集全部細(xì)胞吸入15 mL 離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)液重懸，以1∶2～1∶4 比例接種于同體積培養(yǎng)皿中。

1.2.2 對(duì)結(jié)腸SMC 進(jìn)行ROCK1/ERα與α?SMA 免疫雙標(biāo)

取對(duì)數(shù)生長期的SMC，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，待SMC長至單層時(shí)，吸去培養(yǎng)液，以PBS洗1次，加100%冰丙酮固定10 min，PBS 沖洗3 次，每次10 min，加10%山羊血清封閉1 h，然后吸去山羊血清，分別加α?SMA 一抗（小鼠1∶100）和ROCK1 一抗（兔1∶100），或α?SMA 一抗（兔1∶100）和ERα一抗（小鼠1∶50），陰性對(duì)照不加一抗，4 ℃過夜；PBS 沖洗3 次，每次10 min，避光，加Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（1∶100）和FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，每次10 min；DAPI染核10 min，PBS沖洗3次，每次10 min，鏡下觀察特異性熒光。α?SMA 用于鑒定培養(yǎng)的結(jié)腸SMC［16］。

1.2.3 SMC干預(yù)

取第2～3 代SMC，PBS 沖洗、加無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓12 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)分組：E2不同濃度組（0、10、50、100 nmol/L，24 h）；E2 不同時(shí)間組（0、6、12、24、48 h）；Western blot 和實(shí)時(shí)熒光定量（qRT）?PCR 檢測(cè)SMC 中RhoA、ROCK1 蛋白和mRNA表達(dá)水平，根據(jù)得出的E2最適濃度及時(shí)間進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：ROCK 抑制劑Y27632 不同濃度組（1、5、10、25、50 μmol/L）：Y27632 預(yù)處理1 h 后，加含50 nmol/L E2 的無血清培養(yǎng)液；溶劑對(duì)照組（C 組）：含2 μL DMSO 的無血清培養(yǎng)液；E2 組：含50 nmol/L E2的無血清培養(yǎng)液；PPT組：含1 μmol/L PPT的無血清培養(yǎng)液；DPN 組：含1 μmol/L DPN 的無血清培養(yǎng)液；ICI182780組：1 μmol/L ICI182780預(yù)處理1 h 后，加含50 nmol/L E2 的無血清培養(yǎng)液；BSA?E2 組：含50 nmol/L BSA?E2 的無血清培養(yǎng)液；干預(yù)24 h，用于下面的實(shí)驗(yàn)。溶劑DMSO 的終濃度均不超過1‰。以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)SMC 中RhoA/ROCK 通路中蛋白表達(dá)

RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每泳道加入40～60 μg 蛋白樣品，行SDS?PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入RhoA 抗體（1∶1 000）、ROCK1 抗體（1∶1 000）、p?MYPT1 抗體（1∶1 000）、p?CPI17 抗體（1∶1 000）、p?MLC 抗體（1∶1 000）、β?actin 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。以β?actin為內(nèi)參。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量（qRT）?PCR 法檢測(cè)SMC 中RhoA、ROCK1 mRNA表達(dá)

按TRIzol 試劑說明書，提取各組細(xì)胞總RNA。根據(jù)TaKaRa試劑盒說明書，按10 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以獲得的cDNA為模板行qRT?PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。由系統(tǒng)自動(dòng)記錄熒光曲線并分析計(jì)算出CT值，以GAPDH 作為內(nèi)參。RhoA 上游引物5′?GTTTATGT?GCCCACGGTGTT?3′，下游引物5′?ACTATCAGGGC?TGTCGATGG?3′；ROCK1 上游引物5′?TGTGAAG?CCTGACAACATGC?3′，下游引物5′?CTGACCAC?CAGTCACACTCT?3′；GAPDH上游引物5′?GGCCTT?CCGTGTTCCTACC?3′，下游引物5′?CGCCTGCTTCA?CCACCTTC?3′。

1.2.6 驗(yàn)證E2 抑制RhoA/ROCK 通路的核受體（ERα或ERβ）

分別構(gòu)建ERα、ERβ 的siRNA，待傳代細(xì)胞長至30%～50%，用脂質(zhì)體Lipo2000TM將ERα siRNA、ERβ siRNA 分別轉(zhuǎn)染至SMC 中，以沉默ERα 或ERβ表達(dá)，qRT?PCR 鑒定轉(zhuǎn)染效率，并分為以下組：①對(duì)照siRNA 組；②ERα siRNA 組；③ERβ siRNA 組，轉(zhuǎn)染48 h 后予50 nmol/L E2 刺激，qRT?PCR、Western blot檢測(cè)RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，非參數(shù)檢驗(yàn)之K?S檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性分析，各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；各組間比較采用單因素方差分析和SNK 法兩兩比較，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸SMC鑒定及ROCK1、ERα表達(dá)

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果示結(jié)腸SMC上表達(dá)ROCK1、ERα（圖1）。

2.2 不同濃度和不同時(shí)間E2刺激對(duì)大鼠結(jié)腸SMC中RhoA、ROCK1蛋白和mRNA表達(dá)的影響

10、50、100 nmol/L E2 組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA表達(dá)均低于0 nmol/L對(duì)照組，呈濃度依賴性，因50 nmol/L 組與100 nmol/L 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故50 nmol/L為E2最適濃度（圖2）。

50 nmol/L E2 刺激結(jié)腸SMC 6、12、24、48 h 組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表達(dá)均低于0 h 對(duì)照組呈時(shí)間依賴性，因24 h組與48 h組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故24 h為最適時(shí)間（圖3）。

2.3 不同濃度ROCK 抑制劑Y27632 對(duì)其下游蛋白表達(dá)的影響

5、10、25、50 μmol/L Y27632 組下游信號(hào)蛋白p?MYPT1、p?CPI17、p?MLC 表達(dá)明顯低于0 μmol/L，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1 μmol/L組蛋白表達(dá)亦低于0 μmol/L，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

2.4 鑒定E2抑制RhoA/ROCK通路的受體類型

E2 組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表達(dá)顯著低于C組，β受體激動(dòng)劑DPN組、ICI 182780組、BSA?E2組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 與對(duì)照組無明顯差異。α 受體激動(dòng)劑PPT 組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA表達(dá)亦明顯低于C組（P均＜0.05，圖5）。

2.5 驗(yàn)證E2抑制RhoA/ROCK通路的核受體

轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證：ERα siRNA、ERβ siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸SMC 后，其mRNA 表達(dá)均顯著低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（圖6A）。

siRNA 轉(zhuǎn)染SMC 48 h 后予E2 刺激，ERα siRNA組RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組（圖6B），ERβ siRNA組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

胃腸道動(dòng)力障礙性疾病是臨床常見病、多發(fā)病，大量臨床研究顯示女性發(fā)病率高于男性，提示女性激素在胃腸動(dòng)力的抑制性調(diào)節(jié)中有重要作用［17-19］。多項(xiàng)研究證實(shí)雌激素可松弛膀胱、子宮、尿道等部位平滑?。?0-21］，但對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的直接作用鮮有研究。

RhoA 是小G 蛋白R(shí)ho 亞家族成員之一，分布于大多數(shù)具有收縮功能的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞［22］等，ROCK 是其下游最主要的效應(yīng)分子。ROCK 包括ROCK1 和ROCK 2 兩種亞型，其中，ROCK1 廣泛分布于各種組織中，而ROCK2 主要分布于骨骼肌和腦組織中［23］。本研究對(duì)體外培養(yǎng)的SMC 進(jìn)行α?SMA 與ROCK1 熒光標(biāo)記，均呈陽性表達(dá)，提示大鼠結(jié)腸SMC 上有RCOK1 表達(dá)。RhoA/ROCK 通路可抑制MLCP 活性，增加SMC 對(duì)鈣離子敏感性（鈣敏化機(jī)制），使MLC 磷酸化水平增加，收縮加強(qiáng)［11，24］。研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK 可通過鈣敏化機(jī)制調(diào)控膀胱、尿道、冠脈等平滑肌收縮活動(dòng)［14-15］。Chrissobolis 等［25］發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制大腦基底動(dòng)脈平滑肌RhoA/Rho?kinase 活性。Rigassi 等［13］發(fā)現(xiàn)甲氧雌二醇可抑制人血管平滑肌RhoA 活化，并可減少M(fèi)LC及MLCP調(diào)節(jié)亞基的表達(dá)。而結(jié)腸平滑肌中RhoA/ROCK 的表達(dá)與雌激素的關(guān)系尚不明確。本研究在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)E2可抑制大鼠結(jié)腸SMC 中RhoA/ROCK通路的表達(dá)。

雌激素可通過與膜受體（mER）或核受體（ERα、ERβ）結(jié)合發(fā)揮作用［26-27］，本研究發(fā)現(xiàn)E2 處理后RhoA/ROCK 表達(dá)下降，而非細(xì)胞膜通透的BSA?E2處理后不影響RhoA/ROCK表達(dá)，提示雌激素可通過核受體（ERα、ERβ）途徑發(fā)揮作用。α受體激動(dòng)劑PPT 處理后亦可抑制RhoA/ROCK 表達(dá)，ERα干擾后，E2誘導(dǎo)的RhoA/ROCK表達(dá)上升，驗(yàn)證了雌激素可通過α受體抑制RhoA/ROCK通路表達(dá)。

人體內(nèi)雌激素可隨著年齡、妊娠、月經(jīng)期等不斷變化，不同階段雌激素作用是否不同還仍待進(jìn)一步研究。雌激素是否通過ERα直接介導(dǎo)了RhoA/ROCK通路表達(dá)亦有待研究。