朱家麗，徐 健，韓宏浩，何夢鈺，孔 輝，解衛(wèi)平

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，江蘇 南京 210029

肺纖維化是各種慢性間質(zhì)性肺病的最終階段，其特征是肺實質(zhì)破壞，成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞增殖與活化增多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺換氣功能障礙，呼吸衰竭［1-2］。肺纖維化患者病情進(jìn)展快，病死率高，而目前肺纖維化的治療手段有限且療效欠佳，其中特發(fā)性肺纖維化患者的中位生存期僅2～4年［3］。對肺纖維化機制的進(jìn)一步研究及研發(fā)安全有效的抗纖維化藥物迫在眉睫。近年來研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，是肌成纖維細(xì)胞的重要來源［4］。當(dāng)上皮細(xì)胞受外界損傷因素刺激時，EMT過程被啟動，上皮細(xì)胞逐漸失去極性，轉(zhuǎn)化成紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞，參與肺組織重塑，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展［5］。因此，能夠抑制EMT過程的藥物可能成為潛在的抗肺纖維化藥物。

胰高血糖素樣肽?1（glucagon like peptide?1，GLP?1）是一種腸道L 細(xì)胞分泌的肽類激素，與其特異性受體（GLP?1 receptor，GLP?1R）結(jié)合后，可以促進(jìn)胰島素分泌，具有降血糖作用［6］。近年來發(fā)現(xiàn)，GLP?1R不僅分布于胰腺組織，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟、肺等組織均有表達(dá)，生物學(xué)作用廣泛［7］。利拉魯肽（liraglutide，Li）是目前臨床上常用的一種GLP?1類似物，用于2 型糖尿病的治療［6］。目前已證實Li具有抗炎［8］，減輕心臟［9-10］、腎臟［11］等器官纖維化的作用［11］，提示其可能對纖維化過程中的重要環(huán)節(jié)?EMT 具有調(diào)節(jié)作用。然而，在呼吸系統(tǒng)中，Li 對纖維化的作用及與EMT的相關(guān)性尚未明確。因此，本研究的目的是探討Li 對博來霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的作用及其機制，為肺纖維化的治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

Li（Novo Nordisk公司，丹麥），BLM（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RT?qPCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本），Ⅰ型膠原蛋白α1（collagen type Ⅰalpha 1，COL1α1）、Ⅱ型膠原蛋白α1（collagen type Ⅱalpha 1，COL2α1）、Ⅲ型膠原蛋白α1（collagen type Ⅲal?pha 1，COL3α1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis fac?tor，TNF）?α、白介素（interleukin，IL）?6、IL?1β、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF?β1）PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司），大鼠TNF?α、IL?6、IL?1β ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），上皮細(xì)胞鈣連蛋白（E?cadherin）、TGF?β1 抗體（CST公司，美國），緊密連接蛋白1（zona occluden 1，ZO?1）、閉合蛋白（Occludin）、β?actin抗體（Proteintech公司，美國），α?平滑肌激動蛋白（α?smooth muscle ac?tin，α?SMA）抗體（Abcam公司，英國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及給藥方案

SPF 級成年健康雄性SD 大鼠40 只，體重（220±20）g，由南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。大鼠隨機分為4 組：對照組（Con）、BLM 組、BLM+Li 組、Li 組，每組10 只。1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，BLM 組與BLM+Li 組大鼠予以一次性氣管內(nèi)注入4 U/kg BLM誘導(dǎo)肺纖維化，Con 組和Li 組予以等體積生理鹽水。Li組和BLM+Li 組每日予以皮下注射利拉魯肽（0.2 mg/kg），Con 組和BLM 組分別給予等體積生理鹽水皮下注射。每日監(jiān)測大鼠生存狀態(tài)及體重變化并記錄。給藥28 d 后，處死大鼠，右肺中葉固定于4%多聚甲醛中，其余肺葉凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 肺組織形態(tài)學(xué)分析

肺組織在4%多聚甲醛中固定24 h 后，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片并進(jìn)行HE、Masson三色及甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理變化及肥大細(xì)胞浸潤，每張切片隨機選擇10個不同視野拍照。根據(jù)肺組織切片肺泡周圍間質(zhì)增生及肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度，使用Ashcroft評分評估纖維化程度［12］。用Image?Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計Masson染色圖片中藍(lán)色區(qū)域面積與總面積的比值（%），評估膠原沉積的程度。

1.2.3 肺組織羥脯胺酸含量測定

羥脯胺酸水平間接反映組織的膠原含量。稱取肺組織100 mg，剪碎勻漿，根據(jù)試劑盒操作步驟采用堿水解法進(jìn)行實驗。

1.2.4 ELISA法檢測肺組織勻漿TNF?α、IL?6、IL?1β水平

稱取100 mg 肺組織，加入1 mL PBS 勻漿后于-20 ℃冰箱過夜，2 次凍融后，4 ℃離心機離心，3 000g，5 min，取上清。按照ELISA 試劑盒操作說明進(jìn)行分析。肺組織中TNF?α、IL?6、IL?1β含量最終以pg/mL計算。

1.2.5 免疫熒光染色法檢測肺組織E?cadherin 和α?SMA的表達(dá)

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，放入檸檬酸緩沖液中進(jìn)行高溫修復(fù)，蒸餾水沖洗，3%過氧化氫封閉10 min，PBS 沖洗，1%BSA 濕盒內(nèi)封閉1 h 后滴加含兔α?SMA 抗體（1∶200）、鼠E?cad?herin抗體（1∶200）的一抗，4℃搖床孵育過夜，PBS沖洗，滴加稀釋的二抗（1∶1 000），室溫避光孵育1 h，滴加稀釋的DAPI 染色液，避光孵育10 min 后用熒光猝滅劑封片，使用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.6 RT?qPCR

TRIzol法提取大鼠肺組織總RNA，以β?actin為內(nèi)參，按試劑盒說明進(jìn)行RT?qPCR。引物序列見表1。

表1 目標(biāo)基因的引物序列Table 1 Primer sequences of targeted genes

1.2.7 Western blot

稱取大鼠肺組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，剪碎并勻漿，提取總蛋白，BCA法測蛋白含量，加入適量的5×SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液。蛋白每孔上樣量為15 μL，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h，再分別加入E?cadherin、ZO?1、Occludin、α?SMA、TGF?β1 抗體（1∶1 000），β?ac?tin 抗體（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌后均勻滴入化學(xué)發(fā)光液，上機顯影，以β?actin為內(nèi)參，使用Image J分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD 法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Li對BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的作用

Con和Li組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，間隔正常，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；BLM 組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分肺泡出現(xiàn)斷裂、融合，形成肺大泡，肺泡間隔明顯增厚，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯；BLM+Li 組肺泡破壞，間隔增厚，炎癥細(xì)胞浸潤程度均較BLM 組為輕。Ashcroft 評分結(jié)果顯示，Con 組和Li 組Ashcroft 評分均較低，BLM 組評分明顯增加（P＜0.05），Li 干預(yù)后，Ashcroft 評分較BLM 組顯著下降（P＜0.05，圖1）。

2.2 Li對BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積的作用

Masson 三色染色結(jié)果顯示Con 和Li 組肺泡結(jié)構(gòu)正常，被藍(lán)染區(qū)域極少。BLM組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡融合，被藍(lán)染區(qū)域面積顯著增加，Li 干預(yù)后，上述病變減輕（圖2）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，BLM組膠原沉積面積較Con 組顯著增加（P＜0.05，圖2），BLM+Li 組膠原沉積較BLM 組減輕（P＜0.05）。羥脯胺酸是膠原的主要成分之一，其水平間接反映組織中膠原含量。Con和Li組羥脯胺酸含量無明顯差異，BLM 組羥脯胺酸含量明顯增加（P＜0.05，圖3A），Li 治療后其含量顯著下降（P＜0.05）。RT?qP?CR 結(jié)果顯示BLM 組肺組織COL1α1、COL2α1、COL3α1 mRNA 水平較Con組明顯升高（P＜0.05，圖3B～D），BLM+Li 組mRNA 水平較BLM 組顯著下降（P＜0.05）。

2.3 Li 對BLM 誘導(dǎo)的大鼠肺組織肥大細(xì)胞浸潤及TNF?α、IL?6、IL?1β的作用

甲苯胺藍(lán)染色顯示，Con 及Li 組肺組織肥大細(xì)胞數(shù)量極少，BLM 組可見大量肥大細(xì)胞浸潤（P＜0.05，圖4），予以利拉魯肽治療后肥大細(xì)胞浸潤明顯減少（P＜0.05）。通過RT?qPCR檢測肺組織TNF?α、IL?6、IL?1β的mRNA水平，ELISA法檢測肺組織勻漿中TNF?α、IL?6、IL?1β的含量。結(jié)果顯示，Con與Li組TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)均無明顯差異。與Con組相比，BLM組肺組織TNF?α、IL?6、IL?1β的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05，圖5），BLM+Li組TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)較BLM組明顯減輕（P＜0.05）。

2.4 Li 對BLM 誘導(dǎo)的大鼠肺組織TGF?β1 含量的影響

RT?qPCR 及Western blot 結(jié)果顯示，Con 與Li 組TGF?β1表達(dá)均較低。BLM組TGF?β1 mRNA及蛋白表達(dá)較Con組均明顯升高（P＜0.05，圖6），Li干預(yù)后TGF?β1下調(diào)（P＜0.05）。

2.5 Li 對BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織EMT的影響

Western blot半定量結(jié)果顯示，BLM組肺組織E?cadherin、ZO?1、Occludin 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，圖6A，C），α?SMA 明顯上調(diào)（P＜0.05）。與BLM 組相比，BLM+Li組E?cadherin、ZO?1、Occludin均上調(diào)，α?SMA 下調(diào)（P＜0.05）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Con與Li 組肺組織E?cadherin（紅色）表達(dá)豐富，主要位于肺泡上皮細(xì)胞胞膜上，α?SMA（綠色）表達(dá)量少，僅在血管周圍細(xì)胞胞質(zhì)中可見；BLM 組肺組織E?cad?herin 表達(dá)明顯下調(diào)，肺泡周圍α?SMA 表達(dá)增多；與BLM 組相比，BLM+Li 組E?cadherin 表達(dá)增加，α?SMA表達(dá)減少（圖7）。Li可抑制BLM誘導(dǎo)的肺組織EMT。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，Li除了良好的降血糖作用外，還具有抑制心肌、腎臟纖維化的作用。Li可以減輕糖尿病小鼠心臟的膠原沉積，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖、高血壓、年齡分別誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化模型中，Li治療后小鼠心肌肥厚、膠原沉積程度減輕，MCP?1、波形蛋白（Vimentin）、α?SMA表達(dá)下調(diào)，其可能是通過抑制NF?κB 活化、減少超氧化物產(chǎn)生發(fā)揮抗炎抗纖維化作用［10］。Li 減輕了腎纖維化小鼠腎組織的膠原沉積及纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)［11］。上述研究結(jié)果表明Li 可以減輕組織膠原沉積程度，改善組織纖維化，提示其可能通過調(diào)節(jié)纖維化進(jìn)程中的某些重要環(huán)節(jié)，發(fā)揮抗纖維化作用。本研究使用BLM 誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，探討Li 的抗肺纖維化作用。結(jié)果顯示，Li 可減輕BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，顯著抑制肺組織膠原沉積，降低羥脯胺酸含量及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原mRNA水平，提示Li可減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。

BLM 誘導(dǎo)動物肺纖維化模型的主要特征為肺組織慢性炎癥和纖維化［13］。持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的主要機制之一。當(dāng)組織損傷時，循環(huán)或組織中的炎癥細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）可產(chǎn)生大量趨化因子、細(xì)胞因子（如TNF?α、IL?1β）、生長因子（如TGF?β1）等，這些炎癥因子可以損傷上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞；促進(jìn)上皮及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；招募骨髓前體成纖維細(xì)胞；促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及分化，最終導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增多，肺組織纖維化［14-15］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化動物模型及患者肺組織均可見大量肥大細(xì)胞浸潤，并與纖維化程度相關(guān)?；罨姆蚀蠹?xì)胞可釋放組胺、糜蛋白酶、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、TGF?β1，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖等作用［16-17］。TNF?α是關(guān)鍵的促炎因子，已被證實在肺纖維化中表達(dá)是升高的。BLM 可誘導(dǎo)小鼠肺組織TNF?α表達(dá)升高，而對于TNF?α受體敲除的小鼠，BLM無法誘導(dǎo)其肺纖維化；IL?6在多種慢性疾病中發(fā)揮重要的作用，可由TGF?β1 等因子誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)展；IL?1β是新近極受關(guān)注的重要促炎因子，已被證實參與組織損傷修復(fù)，其在肺纖維化中的作用也逐漸被認(rèn)識。IL?1β可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化，增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積［15，18］。以上3 種炎癥因子均有報道其也可通過增強TGF?β1 誘導(dǎo)的EMT 過程，在肺纖維化發(fā)展中發(fā)揮重要作用［19］。Li已被證實具有良好的抗炎效果，可減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺炎癥浸潤，抑制IL?1β等炎癥因子的表達(dá)［8］。本研究結(jié)果顯示，Li可顯著抑制BLM誘導(dǎo)的肺組織肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤及TNF?α、IL?6、IL?1β炎癥因子的表達(dá)，提示Li可減輕BLM誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)，可能是其減輕肺纖維化的重要原因之一。

TGF?β1 是重要的促纖維化因子，可由炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)炎癥、組織損傷和修復(fù)及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［20］。近年來，EMT被認(rèn)為是纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要機制之一，其中，TGF?β1 是誘導(dǎo)EMT 的關(guān)鍵因子［21］。缺氧、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等可顯著上調(diào)TGF?β1水平，激活其下游信號通路：TGF?β1 與I 型、II 型TGF 受體結(jié)合后，I 型TGF 受體磷酸化，激活下游分子，包括Smad 2/3、MAPK等，進(jìn)一步活化Snail，Twist等EMT轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控EMT相關(guān)分子的表達(dá)［22］，最終導(dǎo)致上皮細(xì)胞表型分子E?cadherin、Occludin、ZO?1等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin、α?SMA等表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化成紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞，參與肺組織重塑［3，23］。已有研究證實，在BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織中TGF?β1表達(dá)升高［24］，誘導(dǎo)EMT參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展［25］，且TGF?β1可體外誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT［26］。既往研究發(fā)現(xiàn)，Li 抑制了腎纖維化小鼠腎組織EMT，其機制可能是通過激活GLP?1R，抑制TGF?β 1/Smad3 和TGF?β1/ERK1/2 通路的活化，從而抑制EMT［11］。Li 可以改善血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心臟纖維化，并抑制TGF?β1/Smad 2/3信號通路［27］。以上研究提示TGF?β1 可能是Li 改善心臟、腎臟纖維化過程的重要調(diào)節(jié)分子之一。在本研究中，BLM 組TGF?β1 表達(dá)較Con 組明顯增加，Li 干預(yù)后TGF?β1表達(dá)明顯下調(diào)，可能部分通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。同時，我們檢測了EMT 相關(guān)指標(biāo)，BLM 組肺組織上皮標(biāo)志分子E?cadherin、ZO?1、Occludin 表達(dá)明顯下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志分子α?SMA 表達(dá)明顯增加，Li 可抑制BLM 誘導(dǎo)的E?cadherin、ZO?1、Occludin 下調(diào)及α?SMA上調(diào)。結(jié)果表明Li可抑制肺組織EMT，可能與下調(diào)TGF?β1的表達(dá)有關(guān)。

GLP?1R是一種G蛋白偶聯(lián)受體，當(dāng)GLP?1與其結(jié)合后，G蛋白被激活，活化腺苷酸環(huán)化酶，使得胞內(nèi)cAMP濃度升高，依賴cAMP的蛋白激酶A（protein ki?nase A，PKA）被激活，產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，GLP?1 可能部分通過激活cAMP?PKA信號通路，下調(diào)高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞TGF?β1 的表達(dá)［28］。cAMP?PKA 信號通路亦參與缺氧誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞EMT 過程［29］。因此，推測Li 可能通過與GLP?1R結(jié)合，激活cAMP?PKA通路，抑制TGF?β1 誘導(dǎo)的EMT。在今后研究中，將進(jìn)一步探討Li如何調(diào)控肺組織EMT及其對TGF?β1下游通路的影響。

肺纖維化患者預(yù)后差，傳統(tǒng)藥物（強的松、乙酰半胱氨酸等）的治療已被證實的無效的。近年來研究顯示吡非尼酮或尼達(dá)尼布可改善肺纖維化，延緩患者肺功能的惡化，然而其有效性及安全性均未完全明確［3］。吡非尼酮已在國內(nèi)上市，但價格昂貴，尼達(dá)尼布目前尚未在國內(nèi)上市。而本研究發(fā)現(xiàn)Li 可明顯減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化，其機制可能與減輕肺組織炎癥反應(yīng)，下調(diào)TGF?β1 水平，抑制肺組織EMT 有關(guān)，且Li 作為臨床廣泛使用的治療2 型糖尿病的降糖藥物，其安全性已被廣泛證實，價格便宜，使用便利，有望成為未來治療肺纖維化的候選藥物之一。