奚佩雯，胡 玥，張 旭，戴欣媛，石 靚，丁 強(qiáng)

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺病中心，江蘇 南京 210029

近年來(lái)，隨著對(duì)RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）的結(jié)構(gòu)和功能的研究逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)RBP 與多種疾病密切相關(guān)［1］，并且在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［2］。RBP通過(guò)影響不同靶基因mRNA的穩(wěn)定性，從而在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。RBP的表達(dá)突變和靶基因中的結(jié)合位點(diǎn)改變涉及多種人類疾病。RNA結(jié)合蛋白7（RNA bind?ing protein 7，RBM7）基因，是以RNA識(shí)別基序（RRM）為主要結(jié)構(gòu)的RBP 家族中的重要成員之一［3-4］。目前，RBM7 主要參與人源性三聚體核外靶向復(fù)合物（NEXT）的構(gòu)成；且作為NEXT 中的關(guān)鍵組分，與hMTR4 和鋅指蛋白ZCCHC8 兩者相互結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能［5-7］。有研究結(jié)果顯示，RNA結(jié)合蛋白38（RNA binding protein 38，RBM38）可以結(jié)合P21的3′端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs）的富含AU 區(qū)（AU?rich elements，AREs），從而穩(wěn)定P21 的mRNA，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期［8］。

P21，也稱CDKN1A，作為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（CDK）的抑制劑，是細(xì)胞周期中的重要調(diào)控因子；可與CDK1和CDK2相互聯(lián)系，在細(xì)胞周期的G1期中發(fā)揮作用［9-10］。P21 的過(guò)表達(dá)可以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)節(jié)。通常，P21作為癌癥相關(guān)基因的作用靶點(diǎn)，直接或者間接參與到癌癥的復(fù)雜過(guò)程中。

本研究將外源性RBM7基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入人源性乳腺癌細(xì)胞株BT474 中，并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBM7 過(guò)表達(dá)及干擾細(xì)胞株。通過(guò)細(xì)胞學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)RBM7 對(duì)乳腺細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，更進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，RBM7 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵因子P21 的表達(dá)。深入機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，RBM7 能與P21 的轉(zhuǎn)錄子直接結(jié)合并發(fā)揮其生物學(xué)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人源性乳腺癌細(xì)胞株BT474 由本實(shí)驗(yàn)室保存。胰酶（上海Beyotime 公司）；DMEM（上海Wisent 公司）；胎牛血清（FBS，上海Fcmacs公司）；慢病毒轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪公司）；RNA TRIzol、PrimeScript RT Reagent 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 試劑（TaKaRa公司，日本）；小鼠抗人β?actin 單克隆抗體（上海Beyotime公司）；兔抗人RBM7多克隆抗體（上海Ab?cam 公司）；兔抗人P21 抗體（Cell Signal Technology公司，美國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP，Millipore公司，美國(guó)）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）蛋白印跡底物（上海Thermo 公司）；青、鏈霉素（上海HyClone 公司）。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（上海聯(lián)科生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BT474 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)BT474細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合至70%左右時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，按30萬(wàn)個(gè)/孔的細(xì)胞量鋪入6孔板中，鋪板18 h后細(xì)胞貼壁，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照慢病毒轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別設(shè)過(guò)表達(dá)RBM7的實(shí)驗(yàn)組（RBM7）和對(duì)照組（NC），干擾RBM7的實(shí)驗(yàn)組（Sh?1和Sh?2）和對(duì)照組（SCR）。

1.2.3 篩選穩(wěn)定細(xì)胞株

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后換為含1 μg/μL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選細(xì)胞株，嘌呤霉素濃度逐步加至3 μg/μL，2周后選出穩(wěn)定表達(dá)的抗性克隆細(xì)胞株保種、傳代［11］。

1.2.4 定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)（qRT?PCR）檢測(cè)RBM7基因的mRNA表達(dá)水平

引物由上海Invitrogen 公司合成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按TRIzol 試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，Prime Script RT Master Mix Perfect Real time 合成cDNA（37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃延伸）。使用SYBR Pre?mix Ex TaqTM試劑，反應(yīng)體系20.0 μL，SYBR 10.0 μL，前后引物10 mol各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL，ROX 0.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s；變性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)（Step One PlusTMReal?time PCR System）。計(jì)算2-△△Ct值為RBM7基因的相對(duì)表達(dá)量。

PCR 反應(yīng)引物序列如下所示：內(nèi)參β?actin：正義5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA?3′；反義5′?CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG?3′。RBM7：正義5′?GAAGCGGATCGCACTCTCTTT?3′；反義5′?CACAAACGCAAACTGCTTTGG?3′。P21：正義5′?TAAGGACTGAGAAATGAAAGTGGA?3′；反義5′?GAGCTTAACTAAATAATAGCCCAATAC?3′。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取待測(cè)細(xì)胞的總蛋白。蛋白樣品加至SDS?PAGE凝膠電泳2 h后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（PVDF）上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，分別與一抗RBM7（1∶500 稀釋）、P21（1∶1 000 稀釋）和β?actin（1∶1 000 稀釋）在4 ℃搖床內(nèi)孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3次，每次10 min，二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育2 h，TBST 漂洗3 次，每次10 min。β?actin作為內(nèi)參對(duì)照。Western blot結(jié)果用凝膠成像儀掃描，用Image?ProPlus 6.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗3遍，75%乙醇固定，4 ℃冰箱過(guò)夜，避光加入400 μL DNA staining solution 后渦旋振蕩5～10 s 混勻。室溫避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析其細(xì)胞周期分布情況［12］。

1.2.7 CCK?8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2 000 個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，設(shè)置只含有培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)6 d，選取固定的時(shí)間點(diǎn)每天進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前吸盡孔中的舊培養(yǎng)液，以100 μL/孔的量加入CCK?8混合液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。2 h后使用酶標(biāo)檢測(cè)儀在450 mm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，獲得吸光度值。

1.2.8 RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀（RIP）

將人乳腺癌細(xì)胞BT474（2×107個(gè)）用RNA 免疫沉淀裂解緩沖液（Millipore公司，美國(guó)）裂解，離心取上清，在4 ℃下分別與5 μg 抗兔RBM7 抗體和抗兔非特異性IgG搖床孵育過(guò)夜。待抗體與RNA以及磁珠結(jié)合后沉淀為復(fù)合物，并對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行RNA 純化。之后，將純化的RNA 進(jìn)一行qRT?PCR、RT?PCR 及瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)［13］。用于檢測(cè)P21和β?actin 的引物序列同前。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。使用t檢驗(yàn)比較兩組獨(dú)立樣本；使用方差分析比較組間差異。實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在乳腺癌細(xì)胞BT474 中構(gòu)建穩(wěn)定的RBM7 過(guò)表達(dá)及干擾細(xì)胞株

首先構(gòu)建了RBM7 過(guò)表達(dá)及干擾慢病毒，并分別轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞BT474 中。轉(zhuǎn)染24 h 后，我們開(kāi)始用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，用量由1 μg/μL 逐步加至3 μg/μL，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞帶有綠色熒光，熒光效果較弱（圖1A）。經(jīng)過(guò)14 d 的嘌呤霉素抗性篩選，細(xì)胞在嘌呤霉素環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代3次，獲得穩(wěn)定表達(dá)RBM7 的帶抗性的BT474 細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞帶有綠色熒光，熒光表達(dá)較前明顯增強(qiáng)（圖1B）。然后，通過(guò)qRT?PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)RBM7 的實(shí)驗(yàn)組（RBM7）和對(duì)照組（NC）之中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組RBM7 的RNA 和蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖（P＜0.05，圖2A、B）；同時(shí)，在干擾RBM7的實(shí)驗(yàn)組（Sh?1和Sh?2）和對(duì)照組（SCR）中，實(shí)驗(yàn)組RBM7的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2C、D）。

2.2 RBM7表達(dá)改變影響乳腺癌細(xì)胞的增殖

用上述構(gòu)建的細(xì)胞株進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CCK?8 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RBM7 過(guò)表達(dá)組（RBM7）的細(xì)胞增殖速度明顯快于對(duì)照組（NC），而RBM7 干擾組（Sh?1 和Sh?2）的細(xì)胞增殖速度明顯慢于對(duì)照組（SCR），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3A、B）。通過(guò)流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RBM7過(guò)表達(dá)后的G1期細(xì)胞數(shù)百分比明顯減少，而S 期和G2 期細(xì)胞數(shù)百分比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3C、D）；而RBM7 干擾組（Sh?1 和Sh?2）較對(duì)照組（SCR）相比，G1 期的細(xì)胞數(shù)百分比明顯增加，而S 期和G2 期的細(xì)胞數(shù)百分比有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3E、F）。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)RBM7可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期的進(jìn)程加快，而干擾RBM7 則可以抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。

2.3 RBM7表達(dá)改變對(duì)P21的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qRT?PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)RBM7 后，P21 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、B）；干擾RBM7后，P21的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4C、D）。

2.4 RBM7能直接結(jié)合P21的轉(zhuǎn)錄子

基于上述所描述的RBM7 與P21 表達(dá)的相關(guān)性，本研究進(jìn)一步通過(guò)RIP 實(shí)驗(yàn)研究了RBM7 調(diào)節(jié)P21 表達(dá)的機(jī)制，將RIP 實(shí)驗(yàn)獲得的mRNA 進(jìn)一步行qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之中，實(shí)驗(yàn)組（RBM7）的P21的mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組（IgG）的明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）。同時(shí)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示加RBM7 抗體復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)組中有P21 的表達(dá)，而加IgG 抗體復(fù)合物的陰性對(duì)照組中無(wú)P21 的表達(dá)。作為陽(yáng)性對(duì)照，RBM7不能與β?actin結(jié)合（圖5B）。這些研究結(jié)果表明RBM7 能直接結(jié)合P21 的轉(zhuǎn)錄子，從而調(diào)節(jié)P21的表達(dá)。

3 討論

RBP 主要在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義［14-15］。具體來(lái)說(shuō)，RBP 直接結(jié)合RNA 的非翻譯區(qū)（UTR），并涉及RNA加工的各個(gè)方面，例如RNA定位、多腺苷酸化、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性和翻譯等，從而參與到細(xì)胞過(guò)程中［16］。所有的RBP 均可與RNA 結(jié)合生成核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein complexes，RNP），且不同的RBP 具有不同的RNA 序列特異性、親和力［17］。RBP 影響著RNA 的結(jié)構(gòu)、RNA 與RNA 之間的相互聯(lián)系，并且在RNP中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。幾乎所有類型的RBP 都直接或間接地參與到蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中［18］。

RBP 通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控翻譯，包括與核糖體競(jìng)爭(zhēng)RNA、直接結(jié)合mRNA 和誘導(dǎo)核糖體捕獲等［19］。其中，RBP直接結(jié)合mRNA較普遍，是將遺傳信息從轉(zhuǎn)錄組傳遞到蛋白質(zhì)組的關(guān)鍵點(diǎn)。RBP覆蓋mRNA形成的結(jié)合物作為翻譯過(guò)程中所需的底物［20-21］。RBP 的3′?UTR 屬于非編碼部分，含有序列特異性RBP 結(jié)合的順式作用元件。3′?UTR 既是mRNA 的穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)定位和翻譯的調(diào)節(jié)元件的儲(chǔ)存庫(kù)，又可以像長(zhǎng)的非編碼或小RNA 一樣發(fā)揮作用［22］。RBP 激活或抑制翻譯過(guò)程，且大多數(shù)已知的實(shí)例是RBP通過(guò)與靶mRNA的3′?UTR結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用的，這有助于實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的局部功能化、區(qū)域化以及協(xié)調(diào)一致性［23］。

本研究中的RBM7 既是RBP 的成員之一，又作為人源性三聚體核外靶向復(fù)合物（NEXT）的關(guān)鍵組成部分，其主要通過(guò)RNA 識(shí)別基序（RRMs）與mRNAs中富含尿苷的序列特異性結(jié)合從而在NEXT中發(fā)揮重要作用［24］。目前，人們主要關(guān)注RBM7 在NEXT 中的結(jié)合方式和作用，然而其在腫瘤中的具體作用機(jī)制尚未可知。

眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展在一定程度上涉及細(xì)胞周期及凋亡等過(guò)程的改變［25］。本研究中CCK?8和流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，人源性乳腺癌細(xì)胞BT474 中過(guò)表達(dá)RBM7 可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)加速細(xì)胞周期的進(jìn)程；而干擾RBM7則可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)阻礙細(xì)胞周期的發(fā)展。細(xì)胞周期涉及眾多因子共同作用，其中P21 起主要抑制作用，通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK1和CDK2結(jié)合，介導(dǎo)多種生物活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程的停滯。P21 在許多腫瘤中都低表達(dá)，并且P21 低表達(dá)與較大的腫瘤形成以及較差的生存情況都有一定的關(guān)聯(lián)性。P21 可與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）結(jié)合，進(jìn)而干擾PCNA 依賴性DNA 聚合酶活性，抑制DNA 復(fù)制，調(diào)節(jié)各種有PCNA 依賴性的DNA 修復(fù)過(guò)程［26-27］。相關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是P21 表達(dá)調(diào)控的重要方式之一，許多RNA 結(jié)合蛋白都被報(bào)道可以調(diào)節(jié)P21的穩(wěn)定性。如紫外線暴露后的HUR 通過(guò)結(jié)合P21 mRNA 的3′?UTR 區(qū)來(lái)提高其穩(wěn)定性；RBM38通過(guò)結(jié)合P21 mRNA的3′?UTR區(qū)發(fā)揮促癌作用；RBMS2 結(jié)合P21 mRNA 的3′?UTR 區(qū)，從而增加了P21的表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用等［28］。

本研究中探索了人乳腺癌細(xì)胞BT474中RBM7的表達(dá)改變對(duì)P21 表達(dá)的影響。初步認(rèn)為，RBM7與P21 的表達(dá)在人乳腺癌細(xì)胞BT474 中呈負(fù)相關(guān)，RBM7 過(guò)表達(dá)可以抑制P21 的mRNA 和蛋白的表達(dá)。通過(guò)RIP 實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究證實(shí)了在人乳腺癌細(xì)胞BT474 中RBM7 直接結(jié)合P21 的mRNA 從而發(fā)揮其負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，RBM7 在人乳腺癌細(xì)胞BT474 中可以通過(guò)直接結(jié)合細(xì)胞周期關(guān)鍵因子P21的mRNA從而抑制P21 的表達(dá)并發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞周期的作用，而RBM7在乳腺癌中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制以及是否涉及調(diào)控其他靶基因的表達(dá)目前尚不明確，有待后續(xù)深入研究。