胡 華，周 忠

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430014

骨肉瘤是常見(jiàn)的骨惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，在青少年和老年人中發(fā)病率較高［1］?；颊? 年生存率為60%～70%，但是對(duì)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者，5 年生存率低于20%［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程［3］。miR?1247是一種與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化及表型高度相關(guān)的miRNA 家族成員［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miR?1247 與胰腺癌預(yù)后相關(guān)且可通過(guò)靶向神經(jīng)素（neuropilins，NRP）抑制細(xì)胞增殖［5］。miR?1247 在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中表達(dá)上調(diào)［6］。然而，目前尚未見(jiàn)miR?1247對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。本研究旨在探討miR?1247在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)增殖和凋亡的影響，并闡明其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

骨肉瘤細(xì)胞系Saos?2、U2OS、143B 及人正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，實(shí)驗(yàn)所需的SOX9 和FAM129B 一抗（Invitrogen 公司，美國(guó)），二抗（Santa Cruz公司，美國(guó)），LipofectamineTM2000 reagent（Invitrogen 公司，美國(guó)）。miR?1247 mimics和陰性隨機(jī)對(duì)照序列scramble的設(shè)計(jì)及合成均由上海吉瑪生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

Saos?2、U2OS、143B 及人正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19 均種植于RPMI 1640 培養(yǎng)基，待48 h 后經(jīng)消化傳代，Saos?2 細(xì)胞系分成兩組，即miR?1247 過(guò)表達(dá)組（miR?1247組）和陰性隨機(jī)對(duì)照組（EV組），利用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR?1247 mimics和陰性隨機(jī)對(duì)照序列scramble。miR?1247 mimics 序列：上游5′?GTTGTTTTTTATTTTGGGAATGTTGA?3′，下游5′?AAAAATACACACTTAACACATCCAAA?CACC?3′；miR?1247 scramble序列：上游5′?UUCUCC?GAACGUGUCACGUTT?3′，下游5′?ACGUGACAC?GUUCGGAGAATT?3′，轉(zhuǎn)染濃度為300 nmol/孔。

1.2.2 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT?PCR）

提取RNA 后，采用NanoDrop1000 分光光度計(jì)對(duì)RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定，在7900 HT 熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems 公司，美國(guó)）測(cè)定。通過(guò)閾值分析比較，采用循環(huán)數(shù)（Ct）法對(duì)數(shù)據(jù)行分析處理。內(nèi)參采用U6，采用2-ΔΔCt法量化miR?1247 的表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞增殖水平測(cè)定

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，將miR?1247組和EV組經(jīng)消化后的細(xì)胞懸液，以2×103個(gè)/孔種植于96孔板上，每孔按200 μL的體積上樣，經(jīng)0、1、3、5、7 d 培養(yǎng)后，每孔加入20 μL MTT，經(jīng)培養(yǎng)1 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下各孔的吸光值D（450 nm），并繪制細(xì)胞增殖曲線，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為時(shí)間。

1.2.4 細(xì)胞凋亡水平測(cè)定

采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，將miR?1247 組和EV 組細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后，采用Binding Buffer 重懸，漂洗2 次后，加入Annexin V，避光染色10 min后，加入PI染料，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，凋亡細(xì)胞為Annexin V陽(yáng)性，PI 陰性細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 蛋白印跡分析（Western blot）

對(duì)miR?1247 組和EV 組細(xì)胞裂解變性，按每孔30 μg的標(biāo)準(zhǔn)上樣，濃縮膠條件為50 min 80 V，分離膠條件為100 min 100 V，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，加入SOX9 和FAM129B一抗，抗體濃度為1∶200，于4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶500）在37 ℃條件下孵育，并經(jīng)4 h孵育后，漂洗3 次，ECL 液顯影，目標(biāo)蛋白灰度值采用Quantity One 1?D 軟件分析。計(jì)算公式：目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH 灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次后，取均值計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?1247低表達(dá)于人骨肉瘤細(xì)胞

qRT?PCR 示，miR?1247 在人正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.02，在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、Saos?2、143B 細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.02、0.39±0.03、0.45±0.04，miR?1247在骨肉瘤細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量低于人正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19（P＜0.05，圖1）。

2.2 miR?1247過(guò)表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖

轉(zhuǎn)染24 h后，miR?1247組miR?1247相對(duì)表達(dá)量為19.72±0.87，EV 組為1.00±0.03，miR?1247 組miR?1247 相對(duì)表達(dá)量顯著高于EV 組（P＜0.001），提示轉(zhuǎn)染成功，可行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2A）；MTT示：轉(zhuǎn)染后0、1、3、5、7 d，EV 組和miR1247 組D（450 nm）值分別為：0.25±0.02vs.0.24 ± 0.02（P＞0.05），0.35 ± 0.03vs.0.37 ± 0.03（P＞0.05），1.37 ± 0.07vs.1.07± 0.06（P＞0.05），2.47 ± 0.15vs.1.67 ± 0.08（P＜0.01），4.03±0.25vs.2.38±0.19（P＜0.001，圖2B）。

2.3 miR?1247過(guò)表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS凋亡

流式細(xì)胞術(shù)顯示，miR?1247 組細(xì)胞凋亡率為（17.90±1.26）%，EV 組為（8.50 ± 1.98）%，miR?1247組細(xì)胞凋亡率高于EV組（P＜0.01，圖3）。

2.4 miR?1247 過(guò)表達(dá)對(duì)SOX9 和FAM129B 表達(dá)的影響

Western blot 顯 示，miR ? 1247 組SOX9 和FAM129B 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.04、0.37±0.04，EV 組分別為1.00±0.02、1.00±0.03，miR?1247組SOX9 和FAM129B 蛋白表達(dá)量低于EV 組（P＜0.01，圖4）。

3 討論

骨肉瘤發(fā)病率約10萬(wàn)分之0.3，發(fā)病高峰在青春期，平均為16歲，65%的骨肉瘤好發(fā)于四肢［1］。化療耐藥及肺轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者生存率低的主要原因［2］。

miR?1247 與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5-6］。在胰腺癌中，miR?1247下調(diào)表達(dá)，且與預(yù)后差相關(guān)，在胰腺癌細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)miR?1247可抑制增殖、克隆形成，并誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，起抑癌基因的作用［5］。在去勢(shì)抵抗的前列腺癌中，miR?1247?5p上調(diào)表達(dá)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR?1247 在骨肉瘤干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且沉默靶基因MAP3K9后，干細(xì)胞增殖和克隆形成能力明顯減弱［7］。在本研究中，miR?1247 低表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、Saos?2、143B，其過(guò)表達(dá)明顯抑制U2OS 細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，提示miR?1247 是作為抑癌基因參與骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程。

SOX9 基因是一個(gè)與骨骼畸形綜合征、軀干發(fā)育異常高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在軟骨分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用［8］。在胰腺癌細(xì)胞中，SOX9蛋白異常高表達(dá)，通過(guò)影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21及CDK4參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［9］。本研究發(fā)現(xiàn)miR?1247 過(guò)表達(dá)顯著抑制SOX9 蛋白水平，說(shuō)明SOX9 可能作為miR?1247的下游靶基因，參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，SOX9 是腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)因子，SOX9 過(guò)表達(dá)激活乳腺癌Wnt/β?Catenin 信號(hào)通路，同時(shí)誘導(dǎo)該信號(hào)通路組件低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LRP6）和T 細(xì)胞因子4 基因的表達(dá)［10］。Wnt/β?Catenin信號(hào)通路是一個(gè)高度復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)、侵襲、遷移、增殖等功能，它的激活對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用［11］。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR?1247 發(fā)揮對(duì)SOX9 的靶向調(diào)控作用是通過(guò)結(jié)合在SOX9編碼區(qū)中高度保守結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的，且它們之間還存在負(fù)反饋回路［4］。提示，miR?1247 可能通過(guò)結(jié)合SOX9 編碼區(qū)特異性序列，降低SOX9 蛋白轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)負(fù)反饋回路加深這一影響，使得Wnt/β?Catenin 信號(hào)通路受抑制，從而阻礙骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

FAM129B 是近期發(fā)現(xiàn)的Wnt/β?Catenin 的正調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與KEAP1 形成復(fù)合體抑制TNFα凋亡途徑、促進(jìn)NF?κB信號(hào)通路，阻礙腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲［12］。之前研究發(fā)現(xiàn)，miR?1247在腫瘤中低表達(dá)，可能損害相關(guān)靶基因的表達(dá)，如細(xì)胞凋亡基因FAM129B［13］。本研究證實(shí)了FAM129B 蛋白受miR?1247 過(guò)表達(dá)影響而表達(dá)下調(diào)，影響FAM129B與KEAP1之間的相互作用，進(jìn)而抑制Wnt/β?Catenin和NF?κB信號(hào)通路，TNF?α凋亡途徑被激活，這可能是影響骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

綜上，miR?1247 可通過(guò)抑制其靶基因SOX9 及FAM129B 的轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、促使凋亡，miR?1247的功能及作用機(jī)制的研究有望為骨肉瘤的診治提供一種新的分子靶點(diǎn)。