程 華，金梅花，董儉達(dá)

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750000；2寧夏醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，寧夏 銀川 750004

隨著人民生活水平的提高，我國心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均顯著升高，給社會和家庭帶來了極大的負(fù)擔(dān)［1］。血管內(nèi)支架植入疏通了堵塞的血管，顯著改善患者的臨床癥狀，然而血管再通后的缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）會激活單核/巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其向損傷部位浸潤和釋放炎癥分子，引起心律失常和心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷等嚴(yán)重后果［2］。因此，調(diào)控炎癥反應(yīng)對于治療I/R 損傷至關(guān)重要。炎癥反應(yīng)與血管生成緊密相關(guān)，低強(qiáng)度的炎癥反應(yīng)會誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）從骨髓動員［3］。EPC 是內(nèi)皮細(xì)胞的前體干細(xì)胞，能歸巢到血管損傷部位，促進(jìn)再內(nèi)皮化和發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［4］。EPC表面則表達(dá)有3個促炎分子：細(xì)胞間黏附分子?1（intercellular adhesion molecule ?1，ICAM?1）、血管細(xì)胞黏附分子?1（vascular cell adhe?sion molecule?1，VCAM?1）和E?選擇素，介導(dǎo)了EPC與單核/巨噬細(xì)胞之間的相互作用。然而在I/R條件下，EPC與單核/巨噬細(xì)胞相互作用還未見相關(guān)報道。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、EGM?2 完全培養(yǎng)基和胰酶（Hyclone 公司，美國）；人淋巴細(xì)胞分離液（天津TBD公司）；CCR7、CD206、CD14磁珠、ICAM?1、VCAM?1 和E?選擇素流式檢測抗體（BD 公司，美國）；ICAM?1、VCAM?1、E?選擇素ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

取健康志愿者的外周血，通過梯度離心的方法分離出單個核細(xì)胞，一部分細(xì)胞置入EGM?2 完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7 d；另一部分細(xì)胞采用CD14 磁珠進(jìn)行分選，PBS 清洗3 次后，將分選的細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 體外缺血再灌注損傷模型構(gòu)建

采用文獻(xiàn)報道的方法構(gòu)建I/R 損傷模型［5］。EPC培養(yǎng)7 d后，棄上清，PBS清洗3次。之后加入不含葡萄糖的D?Hank's 溶液，將其置于通有95%N2、5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h。之后更換為正常培養(yǎng)基，置于通有95%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)置為I/R組。

1.2.3 EPC促炎分子檢測

EPC I/R 損傷處理24 h 后，用胰酶消化。加入ICAM?1、VCAM?1 和E?選擇素流式細(xì)胞檢測抗體，室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次后，在流式細(xì)胞儀上檢測各個分子表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度（mean fluores?cence intensity，MFI）。同時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELI?SA檢測上清中ICAM?1、VCAM?1和E?選擇素的含量。

1.2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)實驗

采用Transwell 小室進(jìn)行EPC 和單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。EPC培養(yǎng)7 d后，分為5組：對照組（EPC細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）、I/R組（I/R損傷EPC細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）、ICAM?1阻斷組（I/R 損傷EPC 細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，同時加入ICAM?1 中和抗體）、VCAM?1 阻斷組（I/R 損傷EPC細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，同時加入VCAM?1中和抗體）和E?選擇素阻斷組（I/R 損傷EPC 細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，同時加入E?選擇素中和抗體）。共培養(yǎng)48 h 后，收集上室的單核/巨噬細(xì)胞，加入CCR7 和CD206 流式細(xì)胞檢測抗體，室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次后，在流式細(xì)胞儀上檢測CD14+CCR7+M1單核/巨噬細(xì)胞和CD14+CD206+M2單核/巨噬細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，兩組之間的比較采用t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注條件下EPC細(xì)胞表面促炎分子E?選擇素表達(dá)增加

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示對照組EPC 表面ICAM?1 和VCAM?1 平均熒光強(qiáng)度分別為1 214 和3.380，I/R 組為1 282 和5.023，兩組之間沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.354，P=0.742；t=1.322，P=0.257）；對照組EPC 表面E?選擇素平均熒光強(qiáng)度為10.89，缺血再灌注組為33.93，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=3.895，P=0.018，圖1）。

2.2 缺血再灌注條件下EPC 促炎分子E?選擇素分泌增加

ELISA 檢測結(jié)果（圖2）顯示對照組EPC 上清中ICAM?1 和VCAM?1 濃度分別為178.0、0.740 ng/mL，I/R 組為199.3、0.903 ng/mL，兩組之間沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.518，P=0.632；t=0.409，P=0.704）；對照組EPC 上清中E?選擇素濃度為3.69 ng/mL，I/R 組為18.17 ng/mL，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=4.568，P=0.010）。

2.3 缺血再灌注條件下EPC促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M1型極化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（圖3）顯示對照組CD14+CCR7+M1 型單核/巨噬細(xì)胞比例為58.83%，I/R 組為81.43%，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=5.394，P=0.006）；ICAM?1 阻斷組和VCAM?1 阻斷組M1 型單核/巨噬細(xì)胞比例分別為79.10%和76.93%，相對于I/R 組，沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.531，P=0.622；t=1.061，P=0.348）；E?選擇素阻斷組M1 型單核/巨噬細(xì)胞比例為59.70%，相對于I/R 組，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=5.950，P=0.004）。

2.4 缺血再灌注條件下EPC 抑制單核/巨噬細(xì)胞向M2型極化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（圖4）顯示對照組CD14+CD206+M2型單核/巨噬細(xì)胞比例為60.57%，I/R組為35.30%，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=6.424，P=0.003）；ICAM?1 阻斷組和VCAM?1 阻斷組M2 型單核/巨噬細(xì)胞比例分別為42.47%和42.03%，相對于I/R 組，沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=2.676，P=0.055；t=1.838，P=0.140）；E?選擇素阻斷組M2 型單核/巨噬細(xì)胞比例為59.07%，相對于I/R 組，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（t=4.179，P=0.014）。

3 討論

心血管疾病是威脅我國人民生命和健康的最大殺手，據(jù)統(tǒng)計目前我國心血管疾病患病人數(shù)近3億，死亡率居首位，高于腫瘤和其他疾病，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。近十年，藥物洗脫支架在臨床廣泛應(yīng)用，使得很多患者能夠得到及時救治，顯著緩解其臨床癥狀［6］。然而血管再通后的I/R 損傷會釋放大量的氧自由基，損傷的細(xì)胞則會釋放大量的炎癥分子，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞向I/R 損傷部分浸潤［7］。單核/巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型2種，M1型為促炎型單核/巨噬細(xì)胞，能夠分泌大量的炎癥分子，包括腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）和IL?6等，這些升高的炎癥分子能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)；M2 型為組織修復(fù)型單核/巨噬細(xì)胞，能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor，TGF?β）等，促進(jìn)組織損傷的修復(fù)和血管生成［8］。本研究發(fā)現(xiàn)在I/R條件下，EPC 能夠促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M1 型極化，引起缺血組織的進(jìn)一步損傷，這為I/R 損傷提供了一個新的機(jī)制。

炎癥反應(yīng)與血管生成緊密相關(guān)，EPC和單核/巨噬細(xì)胞之間相互作用。低強(qiáng)度的炎癥反應(yīng)能夠誘導(dǎo)血管生成，過度或者持續(xù)的炎癥反應(yīng)則會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞［9］。M2 型單核/巨噬細(xì)胞能夠分泌大量促血管生成分子，比如VEGF 和TGF?β等。通過誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞向M2型極化能夠促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞層的修復(fù)和組織的再生修復(fù)［10］。EPC表面則表達(dá)有3個促炎分子：ICAM?1、VCAM?1和E?選擇素，介導(dǎo)了EPC與單核/巨噬細(xì)胞之間的相互作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)在I/R 損傷條件下，E?選擇素表達(dá)和分泌會顯著升高，而ICAM?1和VCAM?1 則沒有顯著的差異。在損傷的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞會高表達(dá)和大量分泌E?選擇素進(jìn)入外周血，誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。本研究發(fā)現(xiàn)EPC能夠通過高表達(dá)和分泌E?選擇素，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M1 型極化，加劇局部的炎癥反應(yīng)，這說明I/R 條件下，EPC 和單核/巨噬細(xì)胞之間的相互作用是通過E?選擇素來介導(dǎo)的。因此，在I/R 損傷治療中，應(yīng)該注意調(diào)控EPC 表面E?選擇素的表達(dá)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在I/R 損傷條件下，EPC 能夠通過高表達(dá)和分泌E?選擇素，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M1型極化，為I/R損傷的治療提供了新靶點。