李陽陽　王曉雪　張峰菊　許宏俠　劉欣欣

[摘要] 目的 探討瘦素對人腦血管平滑肌細胞（HBVSMCs）活性及活性氧（ROS）表達水平的影響。

方法體外培養(yǎng)HBVSMCs，使用不同濃度瘦素干預(yù)HBVSMCs，采用CCK-8法檢測瘦素對細胞增殖活性的影響，蛋白免疫印跡（Western blot）檢測細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）和Ki-67的表達水平，流式細胞術(shù)檢測瘦素對細胞周期的影響，DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)ROS水平。

結(jié)果 CCK-8檢測顯示，不同濃度瘦素處理組培養(yǎng)48和72 h后HBVSMCs的增殖活性明顯升高（F=117.818、160.349，P<0.001）;Western blot檢測顯示，不同濃度瘦素處理組培養(yǎng)48 h后HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調(diào)（F=290.000、898.769，P<0.001）;流式細胞術(shù)檢測顯示，不同濃度瘦素處理組G0/G1期細胞比例降低（F=264.180，P<0.001），S期和G2/M期細胞比例升高（F=160.033、380.234，P<0.001）;DCFH-DA探針法檢測顯示，不同濃度瘦素處理組HBVSMCs內(nèi)ROS水平明顯升高（F=394.025，P<0.001）;以上各指標變化均具有濃度依賴性。

結(jié)論 瘦素能夠促進HBVSMCs的增殖活性，并誘導(dǎo)細胞中ROS的表達。

[關(guān)鍵詞] 瘦素;肌細胞，平滑肌;細胞增殖;活性氧;顱內(nèi)動脈硬化

[中圖分類號] R977.1;R329.24

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0270-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.105

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0935.004.html;2020-05-28 12：03

EFFECT OF LEPTIN ON THE ACTIVITY OF HUMAN BRAIN VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS AND THE EXPRESSION OF REACTIVE OXYGEN SPECIES

＼ LI Yangyang， WANG Xiaoxue， ZHANG Fengju， XU Hongxia， LIU Xinxin

＼ （Department of Geriatric Neurology， the First Affiliated Hospital of Henan University， Kaifeng 475000， China）

[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the effect of leptin on the activity of human brain vascular smooth muscle cells （HBVSMCs） and the expression of reactive oxygen species （ROS）.

＼ Methods＼ HBVSMCs were cultured in vitro and then treated with different concentrations of leptin. CCK-8 assay was used to observe the effect of leptin on the proliferative activity of cells; Western blot was used to measure the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and Ki-67; flow cytometry was used to observe the effect of leptin on cell cycle; the DCFH-DA probe method was used to measure the level of ROS in cells.

＼ Results

The results of CCK-8 assay showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant increase in proliferative activity after 48 and 72 hours of culture （F=117.818，160.349;P<0.001）. The results of Western blot showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had significantly upregulated expression of PCNA and Ki-67 after 48 hours of culture （F=290.000，898.769;P<0.001）. The results of flow cytometry showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant reduction in the proportion of cells in G0/G1 phase （F=264.180，P<0.001） and a significant increase in the proportion of cells in S phase or G2/M phase （F=160.033，380.234;P<0.001）. The results of the DCFH-DA probe method showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant increase in the level of ROS （F=394.025，P<0.001）. All the changes above were concentration-dependent.

＼ Conclusion＼ Leptin can promote the proliferative activity of HBVSMCs and induce the expression of ROS in cells.

[KEY WORDS]＼ leptin; myocytes， smooth muscle;? cell proliferation; reactive oxygen species;? intracranial arteriosclero

心腦血管疾病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，是全世界威脅人類健康的重要原因之一[1]。過去20年來，中國心腦血管疾病死亡率急劇上升[2]。心腦血管疾病的主要病因之一是動脈粥樣硬化，大量研究顯示，高脂血癥、高血壓及糖尿病等多種因素與動脈粥樣硬化的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。瘦素是由肥胖基因編碼的蛋白類激素，能夠調(diào)節(jié)機體多種生理功能[5]。多項研究表明，瘦素具有多種致動脈粥樣硬化的作用[6-7]。目前研究已證實，活性氧（ROS）能夠加速動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]。然而，瘦素是否能夠通過調(diào)控ROS水平在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用的研究報道甚少。因此，本實驗以人腦血

管平滑肌細胞（HBVSMCs）為研究對象，探究瘦素對HBVSMCs細胞活性及ROS水平的影響，為臨床上治療動脈粥樣硬化及心腦血管疾病提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

HBVSMCs由四川大學華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心提供;重組人瘦素由美國Preprotech公司提供;DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國Hyclone公司;胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;CCK-8檢測試劑購自日本同仁化學研究所;增殖細胞核抗原（PCNA）和Ki-67抗體及辣根過氧化酶標記的二抗盒購自美國Santa Cruz公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基科技發(fā)展有限公司;ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

HBVSMCs復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含有體積分數(shù)0.10 FBS、100 mg/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置在含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d更換1次新的培養(yǎng)液，細胞貼壁生長，待細胞融合達90%時以胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的HBVSMCs以胰酶消化，并接種至6孔板中，當細胞單層融合時除去舊培養(yǎng)液，更換成含不同濃度（0、10、100、1 000 μg/L）瘦素的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，將含0 μg/L瘦素的培養(yǎng)液培養(yǎng)的HBVSMCs作為對照組（A組），分別將含10、100、1 000 μg/L瘦素的培養(yǎng)液培養(yǎng)的HBVSMCs作為瘦素低、中、高濃度組（B、C、D組）。各組HBVSMCs作用48 h后進行相關(guān)指標檢測。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期的HBVSMCs，用胰酶消化后接種到96孔板中，分組并處理24、48和72 h，每組的每個時間點設(shè)置5個復(fù)孔。分別向各孔細胞中加20 μL的CCK-8溶液，將細胞培養(yǎng)板放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h，應(yīng)用酶標儀分別測定各組細胞450 nm波長處光密度值（OD值）。實驗重復(fù)3次，取均值，以O(shè)D值表示細胞增殖活性。

1.3.2 Western blot檢測細胞中PCNA和Ki-67蛋白表達水平 收集處理48 h后各組HBVSMCs，加入細胞裂解液在冰上提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。在蛋白中加入適量上樣緩沖液，在沸水浴中加熱變性，取等量蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍到達濃縮膠底部斷開電源，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜放置在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育1 h。TBST洗膜后加入相應(yīng)一抗，PCNA和Ki-67一抗均為1∶1 000稀釋，4 ℃過夜孵育;TBST洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜后加入超敏ECL化學發(fā)光試劑，顯影后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用Image J軟件處理圖像，以β-actin為內(nèi)參照，分別分析各組HBVSMCs中PCNA和Ki-67蛋白的相對表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 瘦素處理48 h后，各組HBVSMCs以胰酶消化，離心收集細胞，加入預(yù)冷PBS重懸細胞，洗滌細胞2次，向細胞中加入1 mL預(yù)冷的體積分數(shù)0.70乙醇溶液，4 ℃固定24 h，PBS洗滌細胞后加入500 μL染色緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中加入PI染液25 μL、RNase A 10 μL，37 ℃避光染色30 min。使用流式細胞儀檢測細胞，以Modfit軟件分析各組HBVSMCs周期。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)ROS水平

各組HBVSMCs處理48 h后收集細胞，嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書要求測定細胞內(nèi)ROS水平，即將DCFH-DA熒光染料以無血清培養(yǎng)液稀釋成10 μmol/L工作液濃度，加入到收集的細胞中混勻，放置在細胞培養(yǎng)箱避光孵育1 h，反應(yīng)結(jié)束后以培養(yǎng)液洗滌細胞。使用流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，以熒光強度表示ROS水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間差異比較采用單因素設(shè)計的方差分析，兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瘦素對HBVSMCs增殖活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（F=117.818、160.349，P<0.001）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（q=8.356～18.800，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（q=10.445、8.235，P<0.05）;在瘦素處理24 h時各組HBVSMCs活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

與對照組比，*F=117.818、160.349，P<0.001;與瘦素低濃度組比，&q=8.356～18.800，P<0.05;與瘦素中濃度組比，#q=10.445、8.235，P<0.05。

2.2 瘦素對HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調(diào)（F=290.000、898.769，P<0.001）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調(diào)（q=13.064～52.842，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平均明顯上調(diào)（q=17.146、26.901，P<0.05）。見圖1。

2.3 瘦素對HBVSMCs細胞周期進程的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比較，瘦素低、中、高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（F=264.180，P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比明顯升高（F=160.033、380.234， P<0.05）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（q=10.091、25.696， P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比均明顯升高（q=5.838～26.203，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（q=15.605，P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比明顯升高（q=11.530、16.507，P<0.05）。見圖2。

2.4 瘦素對HBVSMCs內(nèi)ROS水平的影響

DCFH-DA探針法檢測結(jié)果顯示，對照組、瘦素低濃度組、瘦素中濃度組、瘦素高濃度組ROS水平分別為13.25±1.16、17.33±1.46、35.49±3.86和67.88±6.18。與對照組相比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs內(nèi)ROS水平明顯升高（F=394.025，P<0.001）;與瘦素低濃度組比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs內(nèi)ROS水平明顯升高（q=14.487、40.326，P<0.05）;與瘦素中濃度組相比較，瘦素高濃度組HBVSMCs內(nèi)的ROS水平明顯升高（q=25.839，P<0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病是全世界人類最主要的死亡原因，目前已成為全球性公共衛(wèi)生問題[9]。近年來，隨著人類生活習慣的改變、生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制極其復(fù)雜，多項研究結(jié)果表明，內(nèi)皮損傷炎癥反應(yīng)是造成動脈粥樣硬化的主要原因[10-12]。

血管平滑肌細胞的過度增殖能夠?qū)е卵鼙诎l(fā)生病理變化，造成血管內(nèi)膜損傷，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[13]。瘦素是一類廣泛分布在體內(nèi)的多肽類，由脂肪組織分泌，參與調(diào)節(jié)多種心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。報道指出，瘦素能夠上調(diào)人和小鼠主動脈平滑肌細胞中血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）的表達，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[15]。近期已有研究結(jié)果顯示，瘦素能夠促進大鼠血管平滑肌細胞增殖并抑制細胞凋亡，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中發(fā)揮作用[16]。本實驗采用不同濃度的瘦素干預(yù)HBVSMCs，CCK-8檢測顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地促進HBVSMCs的增殖活性，這與以往關(guān)于瘦素促進血管平滑肌細胞增殖的結(jié)果相符[17-19]。此外，本實驗還通過Western blot檢測HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達水平，研究結(jié)果顯示，PCNA和Ki-67的表達水平均隨瘦素干預(yù)濃度的升高而上調(diào)。PCNA和Ki-67作為增殖細胞核抗原，是反映細胞處于增殖狀態(tài)的指標[20]。本文結(jié)果提示，瘦素通過上調(diào)PCNA和Ki-67的表達促進HBVSMCs的增殖活性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，瘦素能夠降低G0/G1期細胞比例，提高S期和G2/M期細胞比例。這說明經(jīng)瘦素處理后，HBVSMCs進入S期和G2/M期的細胞增多，細胞增殖加快，提示瘦素能夠加快HBVSMCs周期進程來促進細胞增殖。這與周偉強等[21]的瘦素能促進乳癌MDA-MB-231細胞周期進程的結(jié)果相符。

近年來，越來越多的研究結(jié)果表明氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22-24]。ROS是氧化應(yīng)激啟動的關(guān)鍵因子，當體內(nèi)積累過多的ROS時將導(dǎo)致機體氧化與抗氧化的失衡，最終引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激可通過兩方面誘發(fā)動脈粥樣硬化的形成：一方面是通過氧化作用對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)產(chǎn)生毒害作用，影響大分子物質(zhì)的生物功能;另一方面是通過激活相應(yīng)的信號通路引起血管結(jié)構(gòu)和功能的破壞[25]。目前研究結(jié)果顯示，瘦素在乳房健康和惡性腺上皮細胞中通過NADPH氧化酶5誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，激活細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。本實驗通過DCFH-DA探針法檢測瘦素干預(yù)對HBVSMCs內(nèi)ROS水平的影響，結(jié)果顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地誘導(dǎo)ROS的表達。這與先前的研究結(jié)果相符[27-29]。如YU等[30]研究結(jié)果顯示，瘦素能夠誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞增殖及細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的發(fā)生，該過程能夠被熊果酸抑制。還有研究結(jié)果顯示，瘦素可能通過提高細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，參與高血壓動脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程[31]。這些研究提示，瘦素可能通過上調(diào)細胞內(nèi)ROS水平參與動脈粥樣硬化的進展。

綜上所述，瘦素能夠促進HBVSMCs增殖活性并促進細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。本實驗為進一步探究瘦素在動脈粥樣硬化中的作用提供實驗基礎(chǔ)。本研究初步探究瘦素對HBVSMCs增殖活性、周期進程及ROS表達的影響，但未對其作用機制進行探究，后續(xù)實驗將對其補充。并且瘦素對HBVSMCs凋亡、侵襲和遷移等生物學行為是否存在影響尚不清楚，因此后續(xù)實驗也將對此進行探究。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-10-24; [修訂日期]2020-04-17

[第一作者]河南省高等學校重點科研計劃項目（18B310013）

[通信作者]李陽陽（1987-），男，碩士。E-mail：lyyglmc@163.com。