李雨桐，劉子嘉，閆丁榕，雷秀娟

（1.吉林市第一中學，吉林1320011；2.吉林農(nóng)業(yè)大學人參新品種選育與開發(fā)國家地方人參聯(lián)合工程中心，長春130118）

林下參是指在天然林下模擬野山參的生長條件培育而成的人參[1]。在這種新型栽培模式下生長的人參，既能保證其有效的藥用價值，又能在很大程度上緩解野山參資源枯竭帶來的產(chǎn)業(yè)難題[2]。然而由于目前人們對林下參生長關(guān)鍵因子的認識尚不夠全面，在栽培中仍存在許多問題需要解決[3]。

植物組織培養(yǎng)即通過體外無菌操作，將植物的器官、組織、細胞等直接接種在適宜的培養(yǎng)基上，發(fā)育成完整植株的方法[4]。該技術(shù)不僅可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量種苗，也能有效應用于種質(zhì)資源的長期保存，同時也為野生瀕危植物資源的保護做出了巨大貢獻。因此，建立林下參組培快繁體系勢必能為有效解決在栽培中存在的問題提供幫助。本研究以林下參葉片為外植體，探討消毒方式、外源激素濃度和不同年生對其愈傷組織誘導的影響，旨在為林下參組培快繁技術(shù)體系的建立奠定方法基礎(chǔ)，為林下參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)原材料。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺（ZHJH-C1115），上海智城分析儀器制造有限公司；高壓滅菌器（GF54-DA），致微（廈門）儀器有限公司；電子天平（ME104T），梅特勒托利多儀器有限公司；PH 計（Seven Compact-S210），梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 材料

林下參（3、5、10、15 年生），經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學王英平研究員鑒定為撫松長白縣林下參；MS基本培養(yǎng)基（國藥集團，分析純）；蔗糖（國藥集團，分析純）；瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，生化純）；2，4-D（Sigma，生化純）；BA（Sigma，生化純）；水解乳蛋白（Sigma，生化純）；升汞（國藥集團，分析純）；次氯酸鈉（北京化工廠，分析純）。

2 實驗方法

2.1 不同消毒方式的選擇

以展葉期的10年生林下參掌狀復葉的第一片小葉為外植體，選用4種不同的消毒方式進行消毒處理，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，接種在2.4-D 1.5 mg/L+BA 0.5 mg/L+水解乳蛋白1g/L的培養(yǎng)基中，每皿接種5塊，共接種20皿，30天后調(diào)查污染情況和愈傷組織誘導率。

2.2 不同激素配比的選擇

以展葉期的10年生林下參掌狀復葉的第一片小葉為外植體，經(jīng)75%酒精1min，2%NaClO 20 min消毒處理后，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，接種在四種不同激素配比的培養(yǎng)基中，每皿接種5塊，共接種20皿，30天后調(diào)查愈傷組織誘導率和生長情況。

2.3 不同年生林下參愈傷組織形成的比較

以不同年生展葉期的林下參掌狀復葉的第一片小葉為外植體，經(jīng)75%酒精1min，2%NaClO 20 min消毒處理后，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，接種在2.4-D 1.5 mg/L+BA 0.5 mg/L+水解乳蛋白1g/L的培養(yǎng)基中，每皿接種5塊，共接種20皿，30天后調(diào)查愈傷組織誘導率和生長情況。

2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度控制在22～25℃，空氣濕度保持在30%～40%，弱光培養(yǎng)（100 lx）。

2.5 統(tǒng)計分析

利用SAS軟件進行Duncan顯著性方差分析。相關(guān)指標計算公式如下：

污染率 （%）=污染的小葉片塊數(shù)/接種小葉片總塊數(shù)×100%

愈傷組織誘導率 （%）=產(chǎn)生愈傷組織塊數(shù)/非污染的小葉片總塊數(shù)×100%

3 實驗結(jié)果

3.1 不同消毒方式對林下參愈傷組織誘導的影響

利用四種不同消毒方法對林下參葉片進行消毒時，外植體的污染率和愈傷組織誘導率都有顯著差異。其中使用75%酒精30 s，0.1%HgCl210 min的消毒方式，外植體污染率最低，為3.6% ，同時愈傷組織的誘導率也最低，為71.9%；采用75%酒精1min，2%NaClO 10 min的消毒方式消毒時，污染率最高，為15.1%，但同時誘導率也最高，為91.6%，詳見表1。

表1 不同消毒方法對林下參愈傷組織誘導的影響

3.2 不同激素配比對林下參愈傷組織誘導的影響

四種不同的激素配比，對林下參愈傷組織的誘導及生長都有較大影響，詳見表2。外植體接種在2.4-D 2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上時，愈傷組織誘導率最高，為93.4%，并且愈傷組織生長快，顏色呈淡黃色，質(zhì)地松軟；接種在不同的培養(yǎng)基，愈傷組織生長狀況差異很大；當外植體接種在2.4-D 2.0 mg/L+BA0.5 mg/L的培養(yǎng)基上時，其誘導率最低，為36.1%，并且褐愈傷組織化嚴重。

表2 不同激素配比對林下參愈傷組織誘導的影響

3.3 不同年生對林下參愈傷組織誘導的影響

以不同年生的林下參葉片為外植體誘導愈傷組織時，誘導率沒有顯著差異，但愈傷組織生長狀況稍有差異，15年林下參愈傷組織生長比3、5、10年的生長緩慢，并且質(zhì)地較硬，顏色呈乳白色或淡黃色，詳見表3。

表3 不同年生對林下參愈傷組織誘導的影響

4 討論

外植體的消毒，是植物組織培養(yǎng)的首要關(guān)鍵步驟。外植體消毒的好壞，直接影響到材料的脫分化和再分化能力。HgCl2和NaClO是常用的組培消毒劑[5]，本試驗以兩者為消毒劑，配合不同的消毒時間，共設(shè)計四種消毒方式，對外植體進行處理。試驗結(jié)果表明，HgCl2組的污染率和誘導率普遍低于NaClO組，這說明HgCl2的消毒能力強于NaClO，但是HgCl2在起到良好殺菌效果的同時，對外植體也有一定傷害，這與易雙雙等的研究結(jié)果一致[6]。兼顧污染率較低，誘導率較高的篩選原則，我們在后續(xù)試驗中采取了75%酒精1min，2%NaClO 20 min的消毒方式對外植體進行處理。同時，我們在試驗中還發(fā)現(xiàn)，使用同一種消毒方法，對不同年生的葉片進行消毒時，污染率有較大差異（結(jié)果未顯示），這可能與不同年生林下參的帶菌量不同有關(guān)。

激素是影響外植體分化的主要因素，不同的激素配比，對外植體的脫分化能力起決定性作用[7]。一般來講，生長素/分裂素比值高，較易形成愈傷組織[8]。圖1所示為利用四種培養(yǎng)基誘導出的質(zhì)地和長勢均不相同的愈傷組織，經(jīng)過三次繼代后的生長狀況（仍能保持第1代的生長性狀）。本試驗結(jié)果表明，2，4-D濃度在 1.5～2.0 mg/L，BA 濃度在 0.5～1.0 mg/L 的范圍時，林下參愈傷組織誘導率高，且長勢良好，適合于林下參愈傷組織的誘導。在試驗中，可以根據(jù)不同的試驗目的，選擇最佳的培養(yǎng)基配方。

圖1 不同生長情況的愈傷組織

許多研究結(jié)果表明，不同年生的外植體，其愈傷組織形成能力有很大差別[9]，本試驗中卻發(fā)現(xiàn)林下參的生長年限與其葉片愈傷組織誘導率沒有明顯關(guān)系，3～15年的葉片均保持有比較穩(wěn)定的誘導率 （91.2%～94.4%），這可能與本試驗的取材時期和部位有關(guān)。試驗以展葉期的幼嫩葉片為外植體，盡管其參根的生長年限不同，但葉卻為當年新發(fā)嫩葉，不會對愈傷組織的誘導造成影響。