李建英，李曉彤 ，翁 紅，王道新 ，紀(jì)麗巖 ，祁宇祥 ，王 波 ，米廣明

（1.長(zhǎng)白山制藥股份有限公司，吉林132500；1.延邊大學(xué)，延邊133002）

康艾注射液具有益氣扶正，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、婦科惡性腫瘤等疾病?？蛋⑸湟褐饕现蝗藚⑺幱脷v史悠久，古有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱，為歷代中醫(yī)最常用的中藥之一。人參為五加科植物人參 （Panax ginseng C.A.Mey）干燥的根。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，人參具有“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”的功效。其在中醫(yī)藥臨床領(lǐng)域，具有悠久的歷史，隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，對(duì)人參的研究也得到進(jìn)一步的發(fā)展。人參作為單方或復(fù)方中的重要組成之一，已經(jīng)被開發(fā)成很多中成藥[1～4]，其中也包括注射劑。人參皂苷Re和Rg1是人參藥材中的重要有效成分，其含量測(cè)定方法和指紋圖譜分析[5～8]有很多文獻(xiàn)報(bào)道。但目前對(duì)于中藥制劑中間體的質(zhì)量控制研究相對(duì)較少。作為含人參中藥復(fù)方制劑中間體的中人參皂苷Re和Rg1的質(zhì)量控制研究也尤為重要，其含量會(huì)影響中藥制劑最終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，本文采用高效液相法首次測(cè)定作為康艾制劑中間體的不同批次人參提取液中人參皂苷Re和Rg1的含量和指紋圖譜，為中藥制劑生產(chǎn)的全程質(zhì)量監(jiān)控提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀 （Agilent 1200 VWD檢測(cè)器；Agilent 1200 ALS自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent 1200 Bin pump；Agilent Chemstation 色 譜工作 站 ）；METTLER AG245十萬(wàn)分之一天平。

1.2 試藥

人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：110754-200822；純度：88.8%；中國(guó)藥品生物制品檢定所）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201530；純度：91.7%；中國(guó)藥品生物制品檢定所）；實(shí)驗(yàn)中所用乙腈、甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

人參提取液樣品由長(zhǎng)白山制藥股份有限公司提供。

2 色譜條件

色譜柱：島津 VP-ODS（4.6 50 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（20：80）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。

3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 供試溶液的制備

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷 Re、Rg1對(duì)照品 4.60 mg、4.50 mg，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含人參皂苷Re和人參皂苷Rg1分別為0.0408 mg和0.0413 mg的對(duì)照品混合溶液。

3.1.2 供試品溶液的制備

取樣品溶液0.2 mL，加80%甲醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，分析前用微孔濾膜（0.22μm）濾過，濾液作為供試品溶液。

3.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

取3.1.2項(xiàng)下供試品溶液5μL，注入高效液相色譜儀測(cè)試。對(duì)照品及樣品色譜圖分別見附圖1、2。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述配制好的對(duì)照品混合溶液0.5、1、5、10、15、16μL依次注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下分別測(cè)定其中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的峰面積(A)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品的量（mg）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程分別為：人參皂苷 Rg1：Y=372.73X-0.7504，r=0.9998；人參皂苷 Re：Y=309.42X+1.4858，r=0.9992。 人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Re分別在 0.0207～0.6608 μg，0.0204～0.6120μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取人參皂苷Rg1、Re對(duì)照品溶液各5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明：儀器精密良好。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液 5μL，于0，2，4，6，8，10 h 注入高效液相色譜儀，分別測(cè)定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為1.20%和1.70%，結(jié)果表明：樣品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在10 h內(nèi)均穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次樣品，按3.1.2項(xiàng)下制備方法，分別制備6份供試品溶液，各取5μL注入高效液相色譜儀分別測(cè)定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.75%和2.39%。結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

3.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取已知含量的同一供試品溶液6份，精密稱定，分別加入一定量的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對(duì)照品，分別取5μL注入高效液相色譜儀測(cè)定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

3.8 樣品測(cè)定

分別精密吸取3.1.2項(xiàng)下制備好的供試品溶液10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，分別計(jì)算各樣品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量，結(jié)果見表3。

表3 人參提取液中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量

結(jié)果：各批中樣品中的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量分別為 6.48～9.17 mg/ml和 7.40～9.55 mg/ml。

3.9 指紋圖譜的建立與分析

共有峰的標(biāo)定：通過對(duì)8批樣品分析，將色譜圖5～60 min內(nèi)的7個(gè)色譜峰定為共有峰 （見附圖3），其中，特征峰1相對(duì)峰高較高，分離度較好，保留時(shí)間也比較穩(wěn)定，因此，選擇這個(gè)特征峰作為指紋圖譜的參照物色譜峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，確定其為Rb1，結(jié)果見附圖4。

3.9.1 相似度分析

8批樣品的HPLC色譜圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012 A版)進(jìn)行分析，計(jì)算出人參提取液指紋圖譜的相似度。8批人參提取液的色譜指紋圖譜見附圖5，以8批樣品均值生成的共有模式為對(duì)照，計(jì)算各批樣品的相似度，結(jié)果見表4。

表4 8批人參提取液指紋圖譜相似度結(jié)果

4 討論

4.1 由于人參提取液濃度較大，根據(jù)相關(guān)工藝情況，本實(shí)驗(yàn)分別考察了80%甲醇、75%乙醇、水3種不同溶劑作為稀釋溶劑的供試品溶液的方法，結(jié)果表明，用80%甲醇稀釋人參提取液獲得的供試品溶液的HPLC色譜峰形較好，提取效率較高，分離度較好，有利于人參提取液的含量測(cè)定。通過加樣回收率實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度考察，最終確定上述供試品溶液制備方案。

4.2 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了色譜柱考察。考察的色譜柱包括：Intersil ODS-3(4.6 150 nm 5μm）柱、ZoRBA SB-C18(4.6 250mm 5 μm）柱、島津 VP-ODSC18（4.6 50 mm，5μm）柱。結(jié)果表明，島津VP-ODSC18色譜柱分離度較好。

5 小結(jié)

綜上所述，本論文建立了應(yīng)用HPLC法同時(shí)測(cè)定康艾注射液中間產(chǎn)品人參提取液中的人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量的方法及指紋圖譜的建立。該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于人參提取液的質(zhì)量控制。

附圖：