王丹妮 ，張 宸 ，高賢嫻 ，吳 巖 ，洪 鐵 ，

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130012）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種逐漸進(jìn)展的關(guān)節(jié)慢性疾病，系由于勞損、創(chuàng)傷、肥胖等因素引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎等，是一種關(guān)節(jié)整體的退行性病變。臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動受限和關(guān)節(jié)畸形等。其病理特征主要在于對關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨，韌帶，關(guān)節(jié)囊，滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉的影響。[1，2]組方優(yōu)化的陽和膠囊是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院骨科專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，根據(jù)長期臨床實踐總結(jié)出的經(jīng)驗方。全方由補(bǔ)骨脂、熟地、牛膝、生姜、麻黃、肉桂、白芥子、延胡索等多味中藥組成，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院院內(nèi)制劑，組方優(yōu)化的陽和膠囊在多年臨床治療骨關(guān)節(jié)炎疾病方面取得了較好的療效，如老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[3，4］、腰椎間盤突出癥[5]等。骨關(guān)節(jié)炎模型分為誘導(dǎo)性與自發(fā)性兩大類，其中在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶或其混合溶液是化學(xué)因素誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎常用模型之一[6，7]。本研究探討了組方優(yōu)化的陽和膠囊對木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響，以期為組方優(yōu)化的陽和膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎提供更多理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，50只，體質(zhì)量220～250 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，將動物于動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實驗試劑

木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；鹽酸氨基葡萄糖膠囊由北京康必得藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；糖胺多糖（GAGs）試劑盒由上海通蔚科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗儀器

全波長酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 分組給藥與動物模型的建立

將50只Wistar雄性大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，模型組10只，其余各組8只。分別為正常對照組，模型 （10%木瓜蛋白酶+0.03mol/L L-半胱氨酸混合溶液）組，陽性對照鹽酸氨基葡萄糖（0.13g/kg）組，組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組。大鼠分籠飼養(yǎng)。

將10%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L的L-半胱氨酸按1∶1混合靜置30 min后備用。于實驗第0，3，6天，在模型組，陽性對照組，組方優(yōu)化的陽和膠囊高、中、低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.2 mL木瓜蛋白酶混合溶液誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。正常對照組注射等體積生理鹽水。在末次膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶混合溶液后，陽性對照組及各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)濃度受試藥，模型組、正常對照組灌胃給予等體積0.5%CMC-Na，每日一次，共計給藥4周。

2.2 觀測指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般情況

實驗期間觀察各組大鼠毛發(fā)、進(jìn)食量、精神狀態(tài)及活躍程度等一般情況。

2.2.2 大鼠雙膝關(guān)節(jié)寬度變化

測量造模前、給藥前，以及給藥第 1、2、3、4 周的大鼠膝關(guān)節(jié)寬度（mm），每只大鼠測量3次取平均值，按照以下公式計算關(guān)節(jié)腫脹度：

關(guān)節(jié)腫脹度(mm)=致炎后（給藥后）踝關(guān)節(jié)寬度(mm)-致炎前踝關(guān)節(jié)寬度(mm)

2.2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ的含量測定

大鼠麻醉后雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水進(jìn)行灌洗，將關(guān)節(jié)灌洗液在4℃條件下1500r/min離心15min，分離上清后進(jìn)行分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。取其上清液按照ELISA試劑盒說明書的要求測定灌洗液中IL-1β、IL-6及 TNF-ɑ的含量。

2.2.4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中GAGs含量測定

取大鼠雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量滑膜組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成2%滑膜組織勻漿，離心取上清液，離心條件4℃下，3500 r/min，10 min。取適量上清液，采用二甲基亞甲藍(lán)分光光度法根據(jù)說明書的指導(dǎo)測定關(guān)節(jié)滑膜組織中糖胺多糖（GAGs）的含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。根據(jù)檢驗數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用t檢驗比較差異的顯著性。P＜0.05即有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

實驗開始前，各組大鼠膝關(guān)節(jié)活動度正常，各關(guān)節(jié)局部無腫脹；大鼠活動敏捷，靈敏度佳；毛發(fā)光滑，精神狀態(tài)正常，飲食、飲水正常。造模過程中未出現(xiàn)大鼠死亡。造模結(jié)束后各造模組大鼠均出現(xiàn)精神不振，膝關(guān)節(jié)稍有跛行現(xiàn)象。治療4周后正常對照組大鼠膝關(guān)節(jié)活動正常，飲食、飲水正常，毛色光亮，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠均出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)局部腫脹，少動，飲食、飲水減少，反應(yīng)遲純等現(xiàn)象；其余各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度，反應(yīng)敏捷性等均有不同程度的減輕，其中陽性對照鹽酸氨基葡萄糖組及組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組恢復(fù)程度較好。

3.2 大鼠雙膝關(guān)節(jié)寬度變化結(jié)果

實驗結(jié)果表明，正常對照組給生理鹽水前后膝關(guān)節(jié)直徑無變化（P＞0.05）。與正常對照組相比，各造模組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著升高（P＜0.01），各造模組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，陽性對照鹽酸氨基葡萄糖組、組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著降低（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽和膠囊中、低劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)直徑明顯降低（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 組方優(yōu)化的陽和膠囊對大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的作用結(jié)果（x±s）

3.3 大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的結(jié)果

與正常對照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中的 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ含量顯著降低（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽和膠囊中、低劑量組的 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量明顯降低 （P＜0.05），結(jié)果見表 2。

表2 組方優(yōu)化的陽和膠囊對大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量的影響結(jié)果

3.4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中GAGs含量測定

與正常對照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中GAGs含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中的GAGs含量顯著升高（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽和膠囊中、低劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中的GAGs含量明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見表 3。

表3 組方優(yōu)化的陽和膠囊對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中GAGs含量的影響結(jié)果

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎 （Osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、麻木和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的疾病，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、手指關(guān)節(jié)等部位，病理改變以關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)增生為基本特征。隨著全球人口老齡化及肥胖人口的增加，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也逐漸增加，已成為加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、影響人們生活質(zhì)量的社會性問題[[]]。

骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)增生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥因子的大量釋放，造成滑膜和關(guān)節(jié)周圍組織炎癥、軟骨破壞及骨質(zhì)增生等病變。炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-ɑ等均參與骨關(guān)節(jié)炎的病理變化過程。IL-6是引起骨關(guān)節(jié)炎癥的基礎(chǔ)因素，在早、中期骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中存在異常高水平[[]]。IL-1是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的核心因子，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可在轉(zhuǎn)換酶的作用下生成活性更高的IL-1β，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)與局部疼痛[1]。TNF-ɑ在骨關(guān)節(jié)炎的基本病理過程中起著直接促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解及軟骨細(xì)胞破壞的作用[2]。IL-6與IL-1β、TNF-ɑ發(fā)揮協(xié)同作用，加重關(guān)節(jié)炎癥。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組 TNF-ɑ、IL-6、IL-1β 的含量均升高；與模型組相比，組方優(yōu)化的陽和膠囊治療后，TNF-ɑ、IL-6、IL-1β均有所下降，其中以組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組治療效果最為明顯。

軟骨中蛋白聚糖（Proteoglycan，PG）的合成不足是軟骨退變的主要表現(xiàn)之一[10]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)尤其是蛋白聚糖的缺失，可引起軟骨細(xì)胞破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAGs）是構(gòu)成蛋白聚糖的主要成分，是蛋白聚糖的決定性功能基團(tuán)。已有研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)糖胺多糖的合成受阻、降解增加[11]。實驗結(jié)果顯示模型組大鼠軟骨組織中糖胺多糖的含量顯著減少，與模型組相比組方優(yōu)化的陽和膠囊能顯著提高軟骨組織中糖胺多糖的含量，其中以組方優(yōu)化的陽和膠囊高劑量組治療效果最為明顯。

綜上所述，組方優(yōu)化的陽和膠囊在緩解木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的同時，降低了膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ的表達(dá)，提高了軟骨組織中糖胺多糖的含量。提示組方優(yōu)化的陽和膠囊治療木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能是下調(diào)促炎因子的表達(dá)及增加軟骨組織中糖胺多糖的含量來治療骨關(guān)節(jié)炎。關(guān)于組方優(yōu)化的陽和膠囊治療木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。