張 宸 ，高賢嫻 ，楊 楠 ，王丹妮 ，洪 鐵 ，

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長(zhǎng)春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012；）

慢性腎功能衰竭（Chronic renal failure，CRF）又簡(jiǎn)稱慢性腎衰，可由各種疾病如腎小球腎炎、泌尿系統(tǒng)先天畸形、遺傳性疾病等逐漸發(fā)展而來(lái)[1]。CRF進(jìn)展緩慢，但病程發(fā)展一般不可逆，而且病程的某一階段可呈進(jìn)行性發(fā)展和加重，直至發(fā)展成尿毒癥。目前患得該病的人數(shù)達(dá)到數(shù)千萬(wàn)，臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病程發(fā)展[2～3]。近年來(lái)，CRF也引起了中醫(yī)藥研究者的關(guān)注，益腎降濁膠囊具有補(bǔ)腎健脾、益氣利水的功效，又可以逆降清濁、活血化瘀。本文通過制備CRF大鼠模型并灌胃給予益腎降濁膠囊進(jìn)行干預(yù)治療，探討益腎降濁膠囊對(duì)CRF的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)清潔環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，適應(yīng)一周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

益腎降濁膠囊由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，該研究中使用的每g藥膏相當(dāng)于生藥約4.55g；腎衰寧膠囊由云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Scr測(cè)定試劑盒、BUN測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

代謝籠，上海澤雅科教儀器有限公司；BS-124S電子天平，北京塞多利斯系統(tǒng)有限公司；微量移液器，賽默飛世爾儀器有限公司；代謝籠，上海澤雅科教儀器有限公司；超純水系統(tǒng)（AFZ-1002-U），艾科普儀器有限公司；TGL-16B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Biotek公司；倒置顯微鏡，德國(guó)LEICA公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 陽(yáng)離子化牛血清白蛋白的制備

按照文獻(xiàn)[4]的方法，取67ml的無(wú)水乙二胺液，加入500ml雙蒸水，再加入6mol/l的鹽酸350ml，調(diào)整PH至4.75，冷卻至25℃，進(jìn)行攪拌，再加入天然牛血清白蛋白（N-BSA）5g溶于25ml重蒸餾水的溶液，攪拌完全后再加入1.8g炭化二亞胺鹽酸鹽（EDCHCI）維持25℃，持續(xù)攪拌2h，保持PH值4.75，最后加4mol/l的醋酸緩沖液30ml，終止反應(yīng)，即得到等電點(diǎn)提高的C-BSA溶液，將C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的雙蒸水透析72h（3～5h換水一次），冷凍干燥后，即得BSA凍干粉。密封保存于80℃冰箱內(nèi)，注射前用0.01mol/l的PH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成溶液。

2.2 構(gòu)建模型

按照文獻(xiàn)[5]的方法建立膜性腎病模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，測(cè)24h尿蛋白，選擇24h尿蛋白正常的SD大鼠60只，10只作為空白對(duì)照組，另外50只進(jìn)行預(yù)免疫和致病免疫。預(yù)免疫：C-BSA100mg溶于3.75mlPBS中，加入26.25ml弗氏不完全佐劑充分混合乳化，除正常組外，在其余大鼠的雙側(cè)腋下、背部及腹股溝多個(gè)位置皮下注射（每只大鼠注射0.3ml，每點(diǎn)注射不超過0.05ml），每隔1日進(jìn)行1次。致病免疫：在預(yù)免疫一周后，開始正式免疫，大鼠每隔1日尾靜脈注射C-BSA3.5mg/只，每周注射3次，連續(xù)注射4周。

2.3 動(dòng)物分組及給藥

未進(jìn)行模型制作的10只大鼠作為空白對(duì)照組，將模型大鼠分為模型對(duì)照組、腎衰寧組、益腎降濁膠囊高、中、低劑量組，每組10只。每天灌胃給藥一次，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥6周。

2.4 觀察及檢查指標(biāo)

2.4.1 大鼠一般情況

治療完成后，觀察各組大鼠的一般生存狀況，包括精神狀態(tài)、外觀、飲食狀況、死亡情況等。

2.4.2 24h尿蛋白量

分別于造模結(jié)束第0周、第2周、第4周、第6周將大鼠置于代謝籠中，收集大鼠的24h尿液，并記錄尿量，測(cè)定24h尿蛋白量。

2.4.3 血清腎功能指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的含量，具體方法按照試劑盒標(biāo)示方法進(jìn)行。

2.4.4 腎臟組織病變的觀察

取大鼠右側(cè)腎臟置于4%的多聚甲醛溶液固定72h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、展片和蠟脫水化處理，在常規(guī)HE染色后通過導(dǎo)致光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4.5 SOD活性和MDA含量的測(cè)定

取左側(cè)腎臟、加入適量裂解液進(jìn)行研磨勻漿，離心后取上清液，測(cè)定腎臟組織的超氧化物歧化酶SOD活性和MDA含量，具體方法按照試劑盒標(biāo)示方法進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

收集數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，定量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

空白對(duì)照組的大鼠精神狀態(tài)佳，飲食飲水正常，毛色光澤順滑，體重逐漸增加。在造模過程中未出現(xiàn)大鼠的死亡，但模型組的大鼠呈現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，食量明顯減少，飲水大量增加，尿量明顯增多，毛色發(fā)黃、無(wú)光澤。經(jīng)益腎降濁膠囊給藥治療后，各藥物組大鼠的精神狀態(tài)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而精神狀態(tài)逐漸變好，活動(dòng)強(qiáng)度增加，進(jìn)食量增加明顯。

3.2 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠24h尿蛋白定量的影響

造模結(jié)束后，在進(jìn)行給藥治療前模型組與各給藥組24h尿蛋白量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與空白對(duì)組相比，模型對(duì)照組與給藥組24h尿蛋白量明顯增加（P＜0.01）。經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后，各組大鼠的24h尿蛋白明顯低于模型組，結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.01）。 結(jié)果見表 1。

表1 各組大鼠不同時(shí)段24h尿蛋白定量

3.3 益腎降濁膠囊對(duì)血清腎功能監(jiān)測(cè)指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組相比，CRF模型組大鼠血清中的Scr與BUN含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，益腎降濁膠囊給藥組組均能降低CRF模型大鼠的Scr和BUN的含量，具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠血清中Scr和BUN的影響

3.4 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠腎組織病理學(xué)的影響

通過對(duì)各組大叔腎組織病理分析顯示，空白對(duì)照組大鼠的腎組織腎小球結(jié)構(gòu)與數(shù)量正常，腎小管結(jié)構(gòu)正常，官腔未見萎縮。模型組大鼠的腎組織存在局部腎單位萎縮、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎小球囊腔及腎小管存在明顯擴(kuò)張，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)益腎降濁膠囊治療后，上述病理變化較模型組顯著改善。結(jié)果見圖1。

3.5 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠腎臟組織SOD活性和MDA含量的影響

圖1 益腎降濁膠囊組對(duì)CRF大鼠病理變化的影響（HE 400）

與空白對(duì)照組相比，模型組的SOD活性顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)益腎降濁膠囊治療6周后，與模型組相比，各治療組的SOD活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，模型組的MDA含量明顯高于空白對(duì)照組，有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，益腎降濁膠囊給藥組的MDA的含量降低明顯，具有顯著性差異。 （P＜0.05）。 結(jié)果見表 3。

表3 益腎降濁膠囊對(duì)CRF大鼠抗氧化酶和MDA含量的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SD大鼠尾靜脈注射C-BSA 4周后，動(dòng)物出現(xiàn)萎靡不振、脫毛、攝食減少等反應(yīng)，出現(xiàn)大量蛋白尿、血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）顯著增加，說(shuō)明腎功能嚴(yán)重受損。并且在光學(xué)顯微鏡下觀察到腎小球、腎小管的病變，說(shuō)明膜性腎病誘發(fā)大鼠慢性腎衰是成功的。

CRF主要病機(jī)是氣機(jī)升降失常[6]，中藥對(duì)于慢性疾病的治療有獨(dú)特之處，中醫(yī)認(rèn)為該病屬于“關(guān)格”、“癃閉”、“水腫”等范疇[7～8]。 因此，對(duì)于 CRF 的治療，在健脾補(bǔ)腎、祛濕化濁、活血化瘀的基礎(chǔ)上，還要考慮運(yùn)用藥物的四氣五味、升降浮沉來(lái)恢復(fù)臟腑的氣機(jī)的升降特性。益腎降濁膠囊是吉林省中醫(yī)科學(xué)院臨床專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出的方劑。該藥物由熟地黃、杜仲、補(bǔ)骨脂、仙靈脾、女貞子、紅參、黃芪、白術(shù)等十二味中藥組成，方中以熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、益腎填精，杜仲溫補(bǔ)肝腎，二者相伍，雙補(bǔ)腎之陰陽(yáng)，共為君藥。補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精暖脾，仙靈脾補(bǔ)腎壯陽(yáng)，黃芪健脾補(bǔ)氣，利水消腫，紅參大補(bǔ)元?dú)猓恼呒纯芍幵鰪?qiáng)補(bǔ)腎溫陽(yáng)之力，又可健脾益氣、利水消腫，共為臣藥。其他六種中藥助君臣增強(qiáng)補(bǔ)腎健脾、益氣利水之效，又可泥降清濁解毒，兼有活血化瘀之功，全方共奏補(bǔ)腎健脾、降逆清濁之效。

本文通過對(duì)CRF大鼠采用益腎降濁膠囊治療后，檢測(cè)各組大鼠的腎功能指標(biāo)，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的24h尿蛋白量，血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平顯著升高。經(jīng)過益腎降濁治療后，治療組的大鼠的腎功能指標(biāo)顯著降低。通過對(duì)大鼠組織進(jìn)行病理分析顯示，益腎降濁膠囊能夠明顯改善腎組織的萎縮、擴(kuò)張等情況。同時(shí)，益腎降濁膠囊能夠提高SOD活性、降低MDA，具有明顯的抗氧化作用。氧化應(yīng)激是腎臟疾病進(jìn)展的重要因素，益腎降濁膠囊能夠增加機(jī)體中SOD活性從而提高機(jī)體清除氧自由基的能力，減輕自由基對(duì)腎小球的損傷，從而延緩慢性腎衰的進(jìn)程。

綜上所述，益腎降濁膠囊可改善大鼠一般生存狀態(tài)、改善腎功能、抑制腎臟組織病變，產(chǎn)生抗氧化作用，說(shuō)明益腎降濁膠囊能夠緩解大鼠慢性腎功能衰竭。