林 賀 ，劉玥欣 ，任吉祥 ，蘭天野 ，王晉冀 ，徐 巖 ，許佳明 ，律廣富 ，葉豆丹 ，黃曉巍

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春130021）

輕度認知功能障礙（MCI）是正常腦老化發(fā)展為阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）過渡狀態(tài)，由于AD是不可逆轉(zhuǎn)的，因此對MCI進行研究，提早進行干預，對于降低AD的發(fā)病率具有重要意義[1]。岡田酸（OA）是磷酸酯酶抑制劑，能夠引起全局化的磷酸化水平提高，常用于體外MCI模型的制備[2～3]。鹿茸多肽是鹿茸的主要藥效物質(zhì)，能夠催生神經(jīng)元的生成和干細胞的分化，能夠更快促進神經(jīng)軸突的生長，對神經(jīng)系統(tǒng)有滋養(yǎng)的作用[4]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（AKT）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）等是腦組織PI3K/AKT信號通路的重要信號因子，是鹿茸多肽通過PI3K/AKT信號通路治療MCI的潛在靶點[5～6]。本實驗通過OA誘導制備HT22細胞損傷模型，觀察鹿茸多肽對受損細胞內(nèi) PI3K、AKT、Caspase-9表達的影響，探討相關(guān)作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與儀器

鹿茸多肽，長春中醫(yī)藥大學制備（每1g含生藥量28.7g）；OA，上海源葉生物科技有限公司，批號：S43785；MTT，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：030405；PI3K、AKT ELISA試劑盒，上海仁捷生物有限公司， 批號：YY-02217M、FC-98532Q；PI3K、AKT、Caspase-9、GAPDH一抗、HRP二抗，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10176-2-AP、20584-1-AP、10380-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP； 全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光法檢測試劑盒、彩虹245廣譜蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號：BC3711、PC0020、SW2010、PR1920、P1200-2；MCO-17型CO2孵箱，日本三洋公司，型號：EUI3748；倒置顯微鏡，日本 OLYMPUS 公司，型號：CHY4568；Multiskan FC酶標儀，美國Thermo公司；凝膠成像儀，英國UVItec公司，型號：Alliance Q9；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、電泳槽，伯樂 bio-rad，型號：BE6085。

1.2 HT22細胞培養(yǎng)[7]

采用含10%FBS的DMEM/F12中培養(yǎng)HT22細胞，每3d更換50%新鮮培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下觀察生長狀態(tài)。培養(yǎng)2～4h后，HT22細胞逐漸貼壁伸展，形成軸突、樹突相連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)7d至發(fā)育成熟。

1.3 HT22細胞損傷模型的建立[8]

選擇生長狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長的HT22細胞，于5%CO2、37℃條件下，在孵箱中進行分組培養(yǎng)（細胞濃度為 1×106 個/ml，3ml/瓶）。 正常對照組給予DMEM/F12，DMSO對照組給予含 0.01%DMSO的DMEM/F12，OA細胞損傷模型組給予含10nmol/L OA的DMEM/F12，鹿茸多肽高、中、低劑量組給予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 （1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml），于 5%CO2、37℃條件下，孵箱培養(yǎng) 24h。

1.4 MTT法檢測細胞存活率[9]

將HT22細胞接種在多聚賴氨酸包被過的96孔板上 （細胞濃度 1×105 個/ml，200μ/孔）， 于 5%CO2、37℃條件下，孵箱培養(yǎng)7d后，正常對照組給予DMEM/F12，DMSO對照組給予含 0.01%DMSO的DMEM/F12，OA細胞損傷模型組給予含10nmol/L OA的DMEM/F12，鹿茸多肽高、中、低劑量組給予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 （1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 24h。

加入 MTT 工作液（10μl/孔，MTT 濃度為 0.5g/L），培養(yǎng) 4h，棄掉 MTT 工作液后加入 DMSO（100μl/孔），待藍色甲臜結(jié)晶完全溶解后，檢測各組細胞A595/A635吸光值，計算細胞生存率。細胞生存率=（實驗組吸光值/正常對照組吸光值）×100%。

1.5 ELISA檢測受損HT22細胞PI3K、AKT含量

按照ELISA試劑盒說明方法操作，測定450nm波長處吸光度 （A）值，計算各組實驗細胞中PI3K、AKT含量。

1.6 Western Blot檢測受損 HT22細胞 PI3K、AKT、Caspase-9表達水平

按照全蛋白提取試劑盒說明方法提取細胞蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明方法測量蛋白含量，定量后放置于渦旋儀上搖勻，放入100℃水浴加熱10min，放入-80℃儲存。按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明方法制膠，電泳時濃縮膠電壓90V，分離膠電壓110V，電泳完成后，進行轉(zhuǎn)模，轉(zhuǎn)模條件為100v，60min。結(jié)束轉(zhuǎn)模后，TBST洗5min，共3次，5%脫脂牛奶封閉 1h，一抗 TGF-β1（1∶3000）、SMAD7（1∶2000）、PKC（1∶4000），4℃過夜，TBST 洗 10min1 次，洗 5min2次。HRP二抗常溫搖床孵育1h，TBST洗5min，共3次，超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒A、B液等比例混勻后顯色。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料均采用表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞存活率結(jié)果

細胞存活率檢測結(jié)果說明，與正常對照組比較，OA細胞損傷模型組細胞存活率明顯降低 （P＜0.05）；與OA細胞損傷模型組比較，鹿茸多肽高、中、低劑量組細胞存活率明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 細胞存活率結(jié)果（，n=6）

2.2 ELISA檢測各組實驗細胞內(nèi)PI3K、AKT含量結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果說明，與正常對照組比較，OA細胞損傷模型組細胞內(nèi)PI3K、AKT含量明顯降低 （P＜0.01或P＜0.001）；與OA細胞損傷模型組比較，鹿茸多肽高、中劑量組細胞內(nèi)PI3K含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），鹿茸多肽高劑量組細胞內(nèi)AKT含量明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見表 2。

表 2 PI3K、AKT 含量結(jié)果（，n=6）

2.3 Western Blot檢測各組實驗細胞內(nèi) PI3K、AKT、 Caspase-9表達水平結(jié)果

Western Blot檢測結(jié)果表明，與正常對照組比較，OA細胞損傷模型組細胞內(nèi)PI3K、AKT、Caspase-9表達水平明顯降低（P＜0.01 或 P＜0.001）；與 OA 細胞損傷模型組比較，鹿茸多肽高劑量組細胞內(nèi)PI3K表達水平明顯升高（P＜0.05 或 P＜0.01），鹿茸多肽高、中劑量組細胞內(nèi)AKT表達水平明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01），鹿茸多肽高劑量組細胞內(nèi)Caspase-9表達水平明顯升高（P＜0.05），詳見表 3，圖 1。

表 3 PI3K、AKT、Caspase-9 表達水平結(jié)果（，n=6）

圖1 PI3K、AKT、Caspase-9表達水平電泳圖

3 討論

PI3K/AKT信號通路廣泛存在于各種細胞中，是神經(jīng)存活信號轉(zhuǎn)導的主要途徑之一，參與并調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化與遷移，是經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導通路，也是調(diào)節(jié)大腦認知功能的關(guān)鍵信號通路[10～11]。 研究表明，MCI患者因腦內(nèi) PI3K/AKT信號通路受到抑制，進而引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，影響記憶功能。激活PI3K/AKT信號通路，能夠抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善能量代謝，促進神經(jīng)功能的恢復，具有明顯的腦保護作用[12]。Caspase-9是Caspase蛋白家族中一種重要的促凋亡因子，抑制Caspase-9的表達水平可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護作用[13]。本研究通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)通過OA誘導的受損小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞內(nèi)PI3K、AKT表達水平明顯下調(diào)，而鹿茸多肽各劑量組均出現(xiàn)改善，說明鹿茸多肽能夠在一定程度上提高PI3K、AKT表達、抑制Caspase-9表達，減少神經(jīng)細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，鹿茸多肽對OA誘導的鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞損傷模型具有保護作用，作用機制可能與調(diào)控受損細胞內(nèi)表達水平有關(guān)。