蘇云鳳 岳中輝

(1 哈爾濱師范大學(xué)教師教育學(xué)院 150025； 2 哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 150025)

菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物，是世界四大切花之一，已成為全世界普遍栽培的重要花卉。菊花除了具有很高的觀賞價(jià)值外，還具有清熱解毒、平肝明目等藥用價(jià)值。菊花主要靠扦插或嫁接繁殖，需較多的母株材料，且受季節(jié)和外界環(huán)境的限制，繁殖速度較慢。而離體快繁是指利用離體培養(yǎng)技術(shù)，將植物的器官、組織或是細(xì)胞在合適的條件下用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的個(gè)體的方法。對(duì)菊花進(jìn)行離體快繁，可以提高菊花的繁殖系數(shù)和繁殖速度，滿足菊花種苗的市場(chǎng)需求。本文綜述菊花離體快繁的技術(shù)流程，為菊花及其他園藝植物的離體快繁研究提供基礎(chǔ)資料。

1 菊花離體快繁技術(shù)的流程

1.1 外植體的選擇 在進(jìn)行菊花離體快繁時(shí)，首先要進(jìn)行外植體的選擇，目前人們采用的外植體有莖尖、莖段、葉片、花瓣、花蕾、花序軸以及花托等。其中最常采用的是幼嫩的帶芽莖段，其次是幼嫩的莖尖和花瓣。這些外植體可以來(lái)自自然生長(zhǎng)的健壯植株，也可以源自離體條件下由種子培養(yǎng)出的無(wú)菌苗。外植體選擇好后，需要對(duì)外植體進(jìn)行適當(dāng)?shù)男藜簟?/p>

1.2 外植體的滅菌 將修剪后的外植體在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌，常用的滅菌劑是酒精+升汞，即先用70%～75%酒精處理30s，再用0.1%的升汞處理5～20min。當(dāng)外植體是莖尖、莖段、葉片、花蕾時(shí)滅菌時(shí)間為5～8min，外植體是花瓣、花序軸、花托時(shí)滅菌時(shí)間為10～20min。也有學(xué)者用酒精+次氯酸鈉來(lái)滅菌，即先用75%酒精對(duì)未開(kāi)放花蕾進(jìn)行表面滅菌15s，再用次氯酸鈉處理5min(外植體是花瓣)。此外，可用次氯酸鈉和戊二醛作為滅菌劑，對(duì)花蕾進(jìn)行滅菌。

1.3 外植體的接種 若外植體是莖尖或莖段，可將其剪成1～2cm大小，基部切成斜切面，插于培養(yǎng)基上完成接種；當(dāng)外植體是葉片、花瓣時(shí)，可將其切成0.5cm×0.5cm大小的小片，按照形態(tài)學(xué)方向平鋪接種；若外植體是花蕾，需要將其縱切成大小相等的3～6塊，平放著接種于培養(yǎng)基中；若外植體是花序軸或花托時(shí)，則需要把其切成4等塊，并將表面向上進(jìn)行接種。

1.4 外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng) 菊花外植體接種后開(kāi)始進(jìn)行人工誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在24～26℃，濕度控制在65%～85%，光照時(shí)間10～12h/d，光照強(qiáng)度為1000lx～3000lx。培養(yǎng)時(shí)多以MS為基本培養(yǎng)基，加入細(xì)胞分裂素(6-BA、KT)和生長(zhǎng)素(NAA、IBA、2,4-D、IBA)兩類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞分裂素的濃度一般為1.0～2.0mg/L，生長(zhǎng)素的濃度一般為0.1mg/L。若外植體為莖尖或莖段時(shí)，可誘導(dǎo)外植體直接成芽，加入的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑一般是6-BA和NAA；若外植體為葉和花時(shí)，需要先誘導(dǎo)形成愈傷組織然后成芽，加入的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是6-BA或KT和NAA或IBA或2,4-D等。

1.5 芽的增殖培養(yǎng) 在外植體誘導(dǎo)成芽后，需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)進(jìn)行芽的增殖。一般也是以MS培養(yǎng)基，加入6-BA和NAA， 6-BA的濃度一般為1.0～2.0mg/L， NAA的濃度一般為0.1mg/L。

1.6 試管苗的生根培養(yǎng) 增殖后的試管苗長(zhǎng)到2cm高以上時(shí)，即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。大多數(shù)研究是用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，再向培養(yǎng)基中加入NAA， NAA的濃度一般為0.1～0.2mg/L，也有學(xué)者加入IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)，IBA的濃度一般為0.5mg/L。

1.7 煉苗和移栽 當(dāng)生根培養(yǎng)中的根長(zhǎng)到3～4cm、平均根數(shù)2～3條以上時(shí)，即可進(jìn)行煉苗。煉苗時(shí)首先將瓶塞打開(kāi)，讓其由無(wú)菌環(huán)境轉(zhuǎn)至有菌且濕度較低的環(huán)境中鍛煉3d，此時(shí)苗的成活率最高，可達(dá)95%以上。然后將苗取出，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)中。基質(zhì)分為有機(jī)基質(zhì)和無(wú)機(jī)基質(zhì)，有機(jī)基質(zhì)主要有壤土、泥炭土、沙土、草炭、椰糠、腐熟的豬糞等；無(wú)機(jī)基質(zhì)主要有蛭石、珍珠巖、沙等。移栽時(shí)兩種基質(zhì)常搭配使用，最常用的是壤土+珍珠巖。

2 菊花離體快繁中的幾個(gè)技術(shù)問(wèn)題

2.1 外植體的處理 對(duì)外植體需要進(jìn)行5個(gè)方面的處理： ①外植體的清理： 在取得外植體后，需要將其在燒杯中用飽和洗衣粉溶液漂洗或洗潔精水浸泡10～15min，再用蒸餾水沖洗20～30min，去掉表面泥土和雜質(zhì)，防止其污染外植體；②外植體的修剪： 對(duì)外植體進(jìn)行滅菌前，不要把莖上的嫩葉剝得太干凈，以免傷口面暴露太大，導(dǎo)致外植體的損傷，從而影響培養(yǎng)效果；③外植體的滅菌： 用升汞滅菌外植體時(shí)，若處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體污染率雖低，但死亡率增高，若時(shí)間過(guò)短則污染率增高，研究發(fā)現(xiàn)以升汞處理5min效果最好，滅菌成活率達(dá)77.8%。但升汞含有劇毒，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，因此在外植體滅菌時(shí)應(yīng)盡量減少升汞的使用或用其他的滅菌劑代替；④外植體的接種： 在進(jìn)行外植體的接種時(shí)，需將外植體接觸滅菌液的切口切去一小段，可減少滅菌藥物對(duì)外植體的毒害。

2.2 培養(yǎng)基的參數(shù)選擇 涉及2個(gè)方面的問(wèn)題： ①pH值調(diào)節(jié)： pH值對(duì)培養(yǎng)基的凝固度有較大影響，一般培養(yǎng)基的pH在5.6～5.8，pH過(guò)高培養(yǎng)基變硬，過(guò)低培養(yǎng)基不能凝固；②植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比： 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要分為生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，兩者的配比影響植物組織脫分化的方向。當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比例適中，且生長(zhǎng)素含量高于細(xì)胞分裂素時(shí)，主要誘導(dǎo)形成愈傷組織和根原基；當(dāng)細(xì)胞分裂素含量高于生長(zhǎng)素時(shí)，主要誘導(dǎo)形成芽原基。

2.3 試管苗的成活率 由于試管苗一直處于人工控制的適宜環(huán)境，其抗病和抗干旱等能力均較弱，一旦出瓶種植，幼苗的成活率將受到影響，所以移栽初期的管理是移栽成功的關(guān)鍵。由于根系供水緩慢，剛移栽的幼苗要避免強(qiáng)光照射和增加葉表面濕度。但長(zhǎng)時(shí)間的高濕度利于繁殖猝倒病菌，幼苗最易感染細(xì)菌、病毒，引起成活率下降，因此煉苗時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。選擇3d作為煉苗時(shí)間較合適，在移栽2d后要適當(dāng)增加光照和減少濕度。

2.4 試管苗的褐化及玻璃化 在誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中，由于材料基因型、生理狀況和培養(yǎng)條件等因素影響，外植體會(huì)發(fā)生不同程度的褐化，嚴(yán)重影響愈傷分化誘導(dǎo)、再生芽形成。除此之外，在菊花組織培養(yǎng)過(guò)程中，還可能會(huì)產(chǎn)生玻璃化的叢生芽。有研究發(fā)現(xiàn)，AgNO3可防止培養(yǎng)物的褐化與玻璃化。

3 展望

菊花的離體快繁技術(shù)日趨完善，已初步建立了一套菊花組培快繁的培養(yǎng)程序，但該技術(shù)成本較高，所以如何通過(guò)簡(jiǎn)化培養(yǎng)基、簡(jiǎn)化工序以及改進(jìn)移栽技術(shù)等方法來(lái)降低成本，生產(chǎn)出大量廉價(jià)的優(yōu)良植株，是菊花離體快繁技術(shù)亟待解決的問(wèn)題。