高漢云，王翠雪，黃宇如，楊策，王英豪

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.北京預(yù)立創(chuàng)投生物科技有限公司，北京 100000)

鉤吻是馬錢科植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)的全草，又名斷腸草、毒根等，毒性巨大。其主要分布于我國的福建、浙江、廣東、云南、貴州等地，廣泛分布于亞洲東南地區(qū)[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，鉤吻性溫，味辛、苦，有大毒。具有祛風(fēng)散瘀、消腫止痛、攻毒殺蟲的作用。藥理作用及有害毒性的產(chǎn)生主要來源生物堿類中吲哚類或氧化吲哚類等[2]。鉤吻具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，但是由于鉤吻本身具有的毒性，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[3]。在鉤吻減毒方法的研究中，黃美霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)通過赤芝雙向固體的發(fā)酵可以減緩的鉤吻毒性；李德森等[5]證實(shí)羊血、鴨血、豬血能解鉤吻毒性也是客觀性存在，認(rèn)為其可能與其凝血酶有關(guān)；吳水生等[6]研究表明鉤吻經(jīng)過砂炒炮制后毒性也有明顯的降低，同時鎮(zhèn)痛藥效又保留存在。而中藥配伍減毒也是最常用的減毒方法，中藥通過合理的配伍調(diào)其偏性，制其毒性，即可減輕藥物的毒性又可增強(qiáng)藥效，使中藥用藥更加安全。

玉葉金花是茜草科植物玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.)的干燥莖葉，又名山甘草、涼口茶、白紙扇等，主要分布在廣東、廣西、福建等地。其性涼，味甘、微苦，具有清熱解暑，涼血解毒的功效，可用于預(yù)防中暑，治療感冒、支氣管炎等疾病?！陡＝ㄋ幬镏尽贰稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《中藥大辭典》等文獻(xiàn)中有記載，玉葉金花能解鉤吻之毒，并保留鉤吻鎮(zhèn)痛藥效。本研究據(jù)此展開實(shí)驗(yàn)，旨在探討玉葉金花減弱鉤吻毒性的作用機(jī)制，使鉤吻更加安全地應(yīng)用于臨床，同時也為鉤吻相畏減毒存效的理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[7]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級KM種小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重18～22 g；SPF級SD大鼠，雄性，體重200～220 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：滬2012-002，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室[許可證號：SCXK(閩)2014-0005]，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±0.5)℃,晝夜明暗交替時間為12 h/12 h,濕度45%～50%,標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動物自由飲食。

1.2 藥品與試劑 玉葉金花購自福建省福州市閩侯縣，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為茜草科植物玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.)的干燥莖葉；鉤吻購自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為馬錢科植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)的全株。

石油醚(上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(上海泰坦科技股份有限公司)；乙酸乙酯(上海泰坦科技股份有限公司)；無水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)；苦味酸(廣東六山化工廠)；多聚甲醛粉末(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素-伊紅染色液(索萊寶科技公司)；中性樹脂(邁新生物技術(shù)公司)；吲哚美辛片(臨汾奇林藥業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 中草藥粉碎機(jī)(FY135，天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S，上海錦屏儀器儀表有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52，上海亞榮生化儀器廠)；純水器(MILLI-Q，美國Milipore公司)；低溫冰箱(Forma-86c ULT Freezer，美國Thermo公司)；超聲波清洗器(KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(DLSB-5/20，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；石蠟切片機(jī)(RM2015，德國萊卡)，生物組織包埋機(jī)(YB-6LF，湖北孝感亞光醫(yī)用電子公司)；生物組織脫水機(jī)(ZT-14S，湖北孝感亞光醫(yī)用電子公司)；干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；顯微鏡(DM4000B，德國萊卡)；電子天平(FA2004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的制備 精密稱取適量鉤吻藥材，加入5倍量90%乙醇，浸泡30 min后，回流提取1 h，提取2次，合并上清液并減壓回收濃縮，定容至鉤吻提取液濃度為0.05 g·mL-1后，加入3倍量二氯甲烷萃取鉤吻提取液，萃取3次，合并萃取液，減壓回收濃縮即得鉤吻二氯甲烷部位，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取適量玉葉金花藥材，加入5倍量90%乙醇，浸泡30 min后，回流提取1 h，提取2次，合并上清并減壓回收濃縮，定容至玉葉金花提取液濃度為2.0 g·mL-1后分別用3倍量石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取玉葉金花提取液，萃取3次，棄去萃取液，收取水部位，減壓回收濃縮即得玉葉金花水部位，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 減毒作用實(shí)驗(yàn) 將30只SPF級SD大鼠，稱重后按體重均衡原則分為空白對照組、鉤吻組(0.36 g·kg-1)、鉤吻與玉葉金花配伍組(0.36 g·kg-1+14.4 g·kg-1)，每組灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液7.2 mL·kg-1，空白組給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。最后一次給藥后1 h，迅速取出大鼠心、肝、脾、肺、腎，放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，濾紙吸干動物組織表面的液體，放入4%的多聚甲醛中固定。大鼠組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，組織脫水，石蠟包埋制成10 μm切片，再經(jīng)組織脫蠟，最后蘇木精-伊紅(HE)染色。

2.3 扭體實(shí)驗(yàn) 將40只KM種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組10只?？辔端針?biāo)記、小鼠稱重記錄。模型組、吲哚美辛組(0.01 g·kg-1)、鉤吻組(0.27 g·kg-1)、鉤吻與玉葉金花配伍組(0.27 g·kg-1+ 7.12 g·kg-1)分別給藥，各組灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液5.4 mL·kg-1，30 min后腹腔注射0.6%醋酸溶液10 mL·kg-1。觀察并記錄小鼠注射醋酸溶液后15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)(伸展后肢、腹部收縮內(nèi)凹、臀部抬高)的次數(shù)，扭體潛伏時間，按下式計(jì)算鎮(zhèn)痛率。

鎮(zhèn)痛率=(對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/對照組扭體次數(shù)×100%

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對組織病理形態(tài)改變的影響

3.1.1 肺組織HE染色 如圖1所示，空白組肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見病理性改變；鉤吻組與空白組相比，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔呈實(shí)變狀并且充有大量炎性細(xì)胞；而鉤吻與玉葉金花配伍組顯示肺組織結(jié)構(gòu)趨于正常，僅有局部少量細(xì)胞壁稍顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。

圖1 大鼠肺組織藥物毒理切片(HE×200)

3.1.2 脾組織HE染色 如圖2所示，空白組可見脾小體結(jié)構(gòu)清晰，脾臟結(jié)構(gòu)正常；鉤吻組可見脾臟皮質(zhì)內(nèi)有多量含棕褐色色素的巨噬細(xì)胞并可見巨核細(xì)胞，高倍鏡下顯示充有多量紅細(xì)胞；鉤吻與玉葉金花配伍組顯示脾臟結(jié)構(gòu)接近正常，脾小體結(jié)構(gòu)未見明顯改變。

圖2 大鼠脾組織藥物毒理切片(HE×400)

3.1.3 肝組織HE染色 如圖3所示，空白組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心，單行排列成板狀結(jié)構(gòu)；與空白組比較明顯可見鉤吻組有多量炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉內(nèi)個別肝細(xì)胞壞死，核固縮；鉤吻與玉葉金花配伍組可見，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近空白組基本接近正常，門管區(qū)無炎性細(xì)胞。

圖3 大鼠肝組織藥物毒理切片(HE×400)

3.1.4 腎組織HE染色 如圖4所示，空白組大鼠腎小球囊腔清晰可見，腎組織結(jié)構(gòu)正常，沒有明顯變化；鉤吻組腎小球毛細(xì)血管數(shù)目較正常組減少，球囊腔擴(kuò)張，并且腎小球局部多量炎性細(xì)胞浸潤；鉤吻與玉葉金花配伍組腎小球囊腔清晰，腎小球局部僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，并且炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

圖4 大鼠腎組織藥物毒理切片(HE×400)

3.1.5 心組織HE染色 如圖5所示，空白組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰，核居中，間質(zhì)為少量血管及結(jié)締組織；鉤吻組與空白組相較，心肌間質(zhì)增寬，局部小灶性心肌細(xì)胞變性，少量炎性細(xì)胞浸潤；鉤吻與玉葉金花配伍組心肌結(jié)構(gòu)接近空白組，心肌結(jié)構(gòu)基本正常。

圖5 大鼠心組織藥物毒理切片(HE×200)

3.2 對扭體實(shí)驗(yàn)的影響 結(jié)果見表1。與模型組比較，吲哚美辛組、鉤吻組及鉤吻與玉葉金花配伍組均能顯著減少15 min內(nèi)醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)，扭體潛伏時間也明顯延長。與吲哚美辛組比較，鉤吻組及其配伍組的扭體次數(shù)差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，鉤吻組及其配伍組的鎮(zhèn)痛作用差異不明顯，提示鉤吻配伍后仍保留顯著鎮(zhèn)痛作用。

表1 醋酸扭體試驗(yàn)結(jié)果

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與吲哚美辛組比較，#P<0.05

4 討論與結(jié)論

鉤吻主要成分為吲哚類生物堿，其中含量最高是鉤吻素子(koumine)，其次為鉤吻素甲(geliemine)、鉤吻素寅(kouminicine)。鉤吻中的生物堿毒性與煙堿、毒蕈堿類似，具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，會抑制延髓呼吸中樞、腦和脊髓的運(yùn)動中樞，導(dǎo)致呼吸肌麻痹，最終出現(xiàn)呼吸衰竭[8-9]。鉤吻的藥理作用及有害毒性產(chǎn)生均來源生物堿類中吲哚類或氧化吲哚類等[10]。現(xiàn)代研究證明，鉤吻具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。其中鎮(zhèn)痛作用在前期也有研究證實(shí)在多種實(shí)驗(yàn)性疼痛模型上鉤吻素子有明顯抗慢性疼痛的藥理作用，如外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)病理性疼痛、內(nèi)臟平滑肌痙攣引起的絞痛、慢性炎性疼痛和癌癥劇痛等，且治療指數(shù)較高。說明了鉤吻素子發(fā)揮的鎮(zhèn)痛藥理作用有著潛在的研究價值。鎮(zhèn)痛藥在目前臨床應(yīng)用較多的是阿片類，其這類藥物的成癮性極大，使得臨床上的應(yīng)用有所限制。而鉤吻鎮(zhèn)痛不存在成癮性及身體精神依賴性成了研究的熱點(diǎn)。但是，鉤吻在臨床應(yīng)用中常發(fā)生中毒事件，吲哚類生物堿既是其主要活性成分，又是毒性成分。因此，如何減毒是鉤吻安全應(yīng)用需解決的關(guān)鍵問題[11]。

前期研究證實(shí)玉葉金花有減緩鉤吻毒性的作用[12-14]，本實(shí)驗(yàn)亦觀察到鉤吻組給藥30～120 min內(nèi)，大鼠會逐漸出現(xiàn)發(fā)抖、四肢無力以及表現(xiàn)出運(yùn)動失調(diào)狀態(tài)，進(jìn)而興奮并伴有痙攣，繼而出現(xiàn)間歇性的驚厥、跳躍，最后呼吸衰竭死亡。而正常組活動如常；鉤吻與玉葉金花配伍組大鼠給藥30～120 min內(nèi)，異常狀況明顯減輕。故針對配伍后的鉤吻毒性降低進(jìn)一步探討在病理形態(tài)上的改變及鎮(zhèn)痛效果。有研究表明確定其鉤吻素子致小鼠的半數(shù)致死量后，對其心、肝、腎作病理觀察時，病理形態(tài)發(fā)生改變最嚴(yán)重首先出現(xiàn)在肺，肺萎陷導(dǎo)致呼吸面積減少，肺通氣肺換氣不足，二氧化碳不能排除而發(fā)生呼吸性酸中毒。其次酸中毒會使心機(jī)氧化酶受到抑制，心肌的纖維性顆粒明顯改變，肌原纖維和橫紋肌模糊，使得心肌收縮力的減弱，心排血量降低，血管緊張性也降低，血壓的下降，血液循環(huán)障礙。由于血液循環(huán)障礙，肝臟參與合成解毒功能降低，肝受到損害，引起肝細(xì)胞發(fā)生變性，肝小葉中央部位和外周的肝細(xì)胞脂肪變性；血液循環(huán)障礙又可導(dǎo)致腎臟的重吸收和排泄障礙，引起腎臟的變性等。脾、肺臟器作病理觀察時可有大量瘀血出現(xiàn)，臟器的黏膜出現(xiàn)充血、腫脹等[15]。

本研究通過HE染色法觀察鉤吻與玉葉金花配伍后對大鼠組織病理改變的影響，結(jié)果顯示鉤吻與玉葉金花配伍抗炎作用顯著，能顯著降低鉤吻毒性。通過醋酸扭體法疼痛模型來探討鉤吻的鎮(zhèn)痛效果，結(jié)果顯示鉤吻與玉葉金花配伍后對醋酸扭體法引起的小鼠疼痛反應(yīng)有明顯抑制作用，小鼠的疼痛閾顯著提高，鎮(zhèn)痛作用明顯。綜上所述，鉤吻與玉葉金花配伍具有減毒存效的作用，玉葉金花可減緩鉤吻的毒性，具有抑制炎癥的作用。

本研究揭示了鉤吻與玉葉金花配伍在減毒的同時保留了鎮(zhèn)痛療效，其結(jié)果對鉤吻在臨床應(yīng)用上更加明確，同時也為鉤吻與玉葉金花配伍減毒機(jī)制進(jìn)一步研究做了指導(dǎo)。如今，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路是一個研究熱點(diǎn)，醫(yī)學(xué)工作者對疼痛的認(rèn)識已近深入到細(xì)胞分子甚至基因水平，而中藥對細(xì)胞通路的研究也逐漸受到國內(nèi)外研究者的重視。因此，要系統(tǒng)闡述鉤吻與玉葉金花配伍的減毒機(jī)制，還有待于做更深入、更全面的研究，對鉤吻在臨床應(yīng)用上進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。